技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 >应用一种新的毛细管ICP-MS接口进行富硒酵母中含硒蛋白的鉴定

应用一种新的毛细管ICP-MS接口进行富硒酵母中含硒蛋白的鉴定

发布时间:2020-03-19   点击次数:617次

饮食是人体硒 (Se) 的主要来源,该必需元素的摄入主要取决于食品中的硒含量 和所消耗的食物量。由于许多国家农产品中硒的含量很低,所以硒缺乏成为了一 个值得注意的问题。人们已经开发了许多提高人体硒摄入的食品添加策略;富硒 酵母就是人和动物添加剂常用的硒来源之一。

 

评估硒是否充分不仅需要了解硒总含量,而且还要了解各种形态硒的含量。但 到目前为止,大部分研究都仅限于针对占总硒 12-20% 左右的水溶性酵母成分。 酵母的不溶性硒组分很多尚未被发现,表征这类主要组分的工作非常少,其中 Chassaigne 和 Chéry [1] 曾研究过酵母蛋白的硒特异性激光消融 (LA-) ICP-MS 指纹谱,Tastet 等人 [2] 曾用实验室自制的 nanoHPLCICP-MS 接口对富硒多肽进行了硒选择性检测。在常规方法 中,通过测定总硒代蛋氨酸含量(含硒蛋白含量)来评估 富硒酵母的质量。

 

本研究提出了一个安捷伦ICP-MS等离子体质谱辅助的蛋白质组学方法,用于 鉴定富硒酵母中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离不溶 性含硒蛋白。使用 LA-ICP-MS 找出分离后的含硒蛋白斑 点,经切割后,用胰蛋白酶消化;所得多肽通过毛细管 HPLC-ICP-MS 进行分析,然后用电喷雾离子化 (ESI-) MS/MS 进行表征,鉴定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油 醛-3-磷酸酯脱氢酶-3。由于胰蛋白酶裂解产物量非常少, 所以需要使用毛细管色谱。

 

实验部分:

样品 硒含量为 2.3 mg/g 的市售富硒酵母样品。

样品前处理 采用过去文献[3]所述的标准蛋白质组学方法进行蛋白质提 取、双向凝胶电泳分离和目标斑点的胰酶裂解。

HPLC-ICP-MS 和 ESI-MS/MS 分析 使用配备毛细管泵(部件号 G1376A)和手动进样阀(100 nL 定量环)的 Agilent 1100 LC。取 8 µL 胰酶裂解产物加入 到 Agilent Zorbax 300 SB-C18 35 x 0.5 mm 5 µm 多肽卡 套柱上,采用流速 20 µL/min 的等度洗脱,流动相为 2% 乙 腈 (ACN) - 0.1% 甲酸 (FA)。使用流动相冲洗样品 2 分钟, 然后反冲到 Agilent Zorbax 300SB-C18 150 x 0.3 mm x 3.5 µm 分离柱上。使用梯度洗脱分离多肽,A:水 + 0.1% FA;B:ACN + 0.1% FA ,流速 4 µL/min。洗脱程序见表 1。

使用 20 ppb Y、Li、Tl、Ce 的 2% 硝酸溶液优化等离子体 条件和检测参数。使用高能量氦碰撞池模式排除对硒同位 素的多原子干扰。使用各 250 ms 的驻留时间采集 77Se、 78Se、80Se。
ESI LTQ Orbitrap Velos 质谱仪采用正离子模式;加热器 和毛细管温度分别为 50 °C 和 280 °C。采用碰撞诱导解 离 (CID) 在 MS SIM 模式下(15% 标准化碰撞能量)对 300–1100 m/z 质量范围进行测量;碰撞能量设置为 55% 时 HCD 池中产生子离子。

 

结果和讨论
蛋白质在凝胶上的分离结果如图 1 所示。选择用于证明 ICP-MS 辅助蛋白质组学方法可行性的斑点用圆圈标出。根 据 LA-ICP-MS 测量结果,该蛋白斑点在胶上所有斑点中硒 含量高。
对该目标蛋白斑点进行胰酶裂解后的分离色谱图见图 2。毛 细管 HPLC-ICP-MS 检测了 6 个峰(图 2a),其中 5 个可 以用 ESI Orbitrap MS/MS 进行鉴定。ICP-MS 检测对确定 硒肽的保留时间非常重要,可帮助找到质谱图中较小的硒 形态,如图 2d 所示。使用基线 20 点标准差的 3 倍计算检 测限 (LOD)。将该值与 1 ppm SeMet 信号进行比较。所得 到的硒同位素 80 的 LOD(30% ACN,0.1% FA 条件下) 为 0.2 pg。氨基酸缩写列表见表 3。
鉴定出的硒肽序列见表 4。使用 ICP-MS 检测所得信号与 ESI Orbitrap MS 在已鉴定硒肽对应的 m/z 值的选择离子 模式(图 2c)所得的保留时间完全匹配。通过所得数据鉴 定出了含硒的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3(表 5)。证明由 于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒,存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 残基中,后者在酵母样品中*发现。

 

结论:本文建立了有效的安捷伦ICP-MS辅助蛋白质组学方法,用于鉴 定市售富硒酵母样品不溶性硒组分中的含硒蛋白。采用双 向凝胶电泳分离含硒蛋白,并用胰蛋白酶进行裂解。采用 LA-ICP-MS、毛细管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 组合 方法对裂解产物进行鉴定、分析和表征。由于胰酶裂解产 物量非常少,所以需要使用毛细管色谱。采用本方法鉴定 出了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3,这是富硒酵母中的主要含 硒蛋白。证明由于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒,存 在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 残基中,后者在酵母样品 中*发现。

 

 

 

在线咨询
在线客服
咨询热线

18602175640

[关闭]