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赛默飞离子色谱法测定全血样品中的胆碱

发布时间:2020-06-27   点击次数:701次

引言:胆碱是一种水溶性B族维生素,在水溶液中以四价铵阳离子形式存在,是 正常代谢不可缺少的物质。准确分析全血样品中的胆碱,对于代谢等生物领域 具有很重要的作用,是新型反应急性冠脉综合症的指标,在医学领域意义重 大。同时胆碱(Choline)作为一种营养食品添加剂,具有促进大脑的发育、改 善大脑的代谢、促进神经系统的信息传递、增强视力、改善钙的代谢等功能[1]。
国标中检测胆碱的方法有GB/T 5413.20-1997《婴幼儿配方食品和乳粉 胆碱的测定》[2],该方法采用酶水解,分光光度法进行测定,成本高效率低。 近年来文献报道食品中胆碱的测定方法为液相色谱法[3]和离子色谱法[4-6],液相 色谱法一般采用蒸发光散射检测器进行检测,而此检测器非常用检测器,该 方法不易推广。离子色谱电导检测器检测灵敏度高,选择性好,易推广,在 食品检测方面应用较多,但是应用于全血样品中胆碱的检测鲜有报道。血样 不同于常规的食品样品,不易分散。实验室采用曲那通-X100对血样进行分散 处理后,采用盐酸水解,离子色谱进行检测。方法简单易行,准确可靠,实 验结果满足检测的要求。

 

测试条件:
仪器和试剂
赛默飞ICS-3000离子色谱系统(美国Dionex公司),电导 检测器;自动进样器及Chromeleon色谱数据处理工作 站;MiliQ-Element纯水机(法国Millipore);KQ-500E型 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水 浴锅(北京长安科学仪器厂);0.22 µm尼龙滤膜。 胆碱酒石酸氢盐(纯度98.0%,日本TCI试剂) ; MiliQ-Element超纯水;盐酸(优级纯,北京化工厂);曲 拉通X-100(化学纯,西陇化工股份有限公司);甲烷磺 酸(色谱纯,sigma公司)。文中所用血样为鸡血样品。
色谱条件
色谱柱:IonPac CS12分析柱 (250 mm×4 mm)和 IonPac CG12保护柱(50 mm×4 mm); 淋洗液:甲烷磺酸(16 mmol/L); 抑制器:CSRS 300 4 mm ,外接水抑制模式。 进样体积:100 µL。
 

样品前处理方法:
准确称取约2 g全血样品(真空采样,保存于4 ℃ 冰箱中可保持30天)于50 mL具塞玻璃锥形瓶中,加入 27.5 mL 1.0%的曲拉通-X100溶液,超声15 min,再加 入1.5 mL盐酸,加盖,混匀。将锥形瓶放入70 ℃水浴 3小时,每小时摇一次。将水解产物冷却至室温,用水 冲洗锥形瓶,所得溶液过滤至容量瓶中,将滤液定容至 100 mL,此滤液可以在4 ℃下保存三天。分析前用水继续 稀释此滤液10倍后,过0.22 µm尼龙滤膜。同时准备试剂 空白。

结果和讨论:
前处理条件的选择
血样不同于粉末的食品样品,凝固后很难在水溶液中 均匀分散,会大大的影响提取效率。实验室采用了0.5 % 曲拉通X-100溶液(一种表面活性剂)对血样进行分散, 并且采用超声提取以提高提取率。实验室考察了超声时 间(15 min、30 min、45 min、60 min)对提取效率的影 响,从图1可以明显的看出,当超声时间达到15 min后, 提取率就没有明显的变化,因此实验室选择15 min作为超 声时间。

同时也考察了水解溶液中盐酸的用量,选择某血 样,研究采用不同的盐酸溶液配是否会影响血样的水解 效率,不同的盐酸配比条件采用实验室建立的方法进行 检测,所得结果见表1。 方法1盐酸用量越大,所得滤液酸度较高,若直接 进样会使阳离子交换官能团发生质子化,色谱峰严重变 形,因此必须再稀释5倍后再进样。而采用方法2和方法 3进行前处理,所得滤液酸度就适合直接进样分析,且已 经满足了水解的效果。方法3稀释倍数增大一倍,样液 中胆碱的含量也能达到检出限的要求,且溶液更容易过 滤,可以进一步提高工作效率,所以实验室采用了方法3 的盐酸用量进行前处理。
 

色谱柱的选择
在常用的阳离子色谱柱中,IonPac CS17色谱柱同 样可以分析血样中的胆碱,淋洗液浓度为6 mM的甲烷磺 酸,对于IonPac CS17色谱柱分析奶粉中的胆碱色谱峰 对称性更好,所用淋洗液浓度低。但钠离子、铵离子和 钾离子的分离度不好,并且IonPac CS17更容易发生阳 离子交换官能团的质子化现象,与IonPac CS12A色谱柱 相比,前处理后的溶液需要多稀释5倍后进样。可能会 影响含量较低的血样的定量。所以实验室采用了IonPac CS12A作为检测用色谱柱,等度淋洗。对于分离效果较 好的新的色谱柱来说,淋洗液的浓度不超过20 mmol/L 均能满足分离的要求。由于血样中成分较为复杂,钾含 量较高,如果淋洗液浓度太高,钾离子拖尾现象比较严 重,所以终采用了16 mmol/L作为淋洗液条件

结论:
本方法采用盐酸酸解,使全血样品中的胆碱释放出 来,前处理方法对胆碱提取效率高。处理后的样品溶液 使用IonPac CS12A色谱柱分析,抑制电导检测,胆碱色 谱峰型良好,检测灵敏度高,且可以同时测定其他5种常 见阳离子。

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