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使用LC-MS/MS系统对神经酰胺和己糖基神经酰胺进行高通量靶向筛查

发布时间:2020-09-08   点击次数:456次

应用优势 ■ 快速定量血浆和血清中的24种神经酰胺、 23种己糖基神经酰胺以及鞘氨醇 ■ 使用Quanpedia™和SOP构建性能稳定、便于部署的平台,降低方法开发和培训成本 ■ 使用TargetLynx™软件和第三方信息学软件(即Skyline)实现快速数据处理和数据可视化 ■ 比同类工作流程更快、更经济

简介鞘脂(SLs)是脂质中的一类,包括神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和较为复杂的鞘糖脂。所有SLs都有一条“长链”,也就是鞘氨醇碱基链1 。这些碱基是鞘氨醇(SPH)等有机脂肪族氨基醇或者结构相似化合物(图1)。这些化合物是细胞膜的重要组成部分,与多种生物功能有关,包括细胞信号转导和细胞凋亡2,3。SLs在诱导肿瘤细胞增殖、研究化疗耐药机制方面起着关键的作用4 ,另外已有研究发现,帕金森患者体内的神经酰胺(Cer)和己糖基神经酰胺(HexCer)含量偏高5 。 SLs代谢转化快、代谢物种类繁多且功能相似,给单独研究某一种鞘脂的功能带来了很大难度。

虽然质谱(MS)技术的进步让研究人员得以进行更深入的脂质组学分析,但鉴定和定量分析依然比较困难。脂质有大量的同分异构和同量异位物质。此外,MS谱图中通常有多种化合物的峰和碎片,要想对特定的分子进行明确鉴定和相对定量,不仅难度大,而且极为耗时。这严重阻碍了实验室之间的脂质组学数据传递,导致研究人员难以通过多地点研究得出生物学解释。本研究使用基于亲水作用色谱(HILIC)的方法分离不同类别的脂质,然后使用MS进行检测,从而降低了鉴定结果的不确定性6 。按照图2. 大多数研究实验室的通用脂质组学工作流程,图中突出显示了LipidQuan工作流程。类别分离不同的脂质还可以减少定量分析所需的稳定同位素标记(SIL)标准品,进而降低成本。本应用纪要介绍了在LipidQuan平台(图2)上运行基于HILIC的方法对Cer、HexCer、SPH进行的靶向筛查。

 

实验:样品向混合的健康人血浆中添加稳定同位素标记(SIL)的SLs(氘代CERAMIDE LIPIDOMIX™,Avanti Lipids,美国亚拉巴马州阿拉巴斯特),制备九个不同浓度的标准品用于绘制定量用标准曲线。分析物的浓度范围如下:C16神经酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0) = 2.2-1090 ng/mL、C18神经酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)= 1.2-575 ng/mL、C24神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0) =2.6-1315 ng/mL、C24:1神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1) = 1.3-665 ng/mL。另外,通过萃取前加标的方式向NIST标准参比物质® 1950血浆中(Sigma Aldrich,英国普尔)添加5% SIL,制备6个重复样。样品制备样品制备方案很简单,使用预冷的异丙醇(IPA)沉淀蛋白(1:5,血浆:IPA)即可。将样品涡旋混合1 min,在-20 °C下放置10 min。接着再将样品涡旋混合1 min,然后在4 °C下放置2 h,确保蛋白沉淀完全。将萃取的样品在4 °C下离心10 min(大离心力10,300 g),然后将上清液转移至玻璃样品瓶,进行LC-MS/MS分析。

实验 LC条件 LC系统: ACQUITY UPLC I-Class液相色谱系统固定定量环(FL)或流通针式(FTN) 色谱柱: ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm 柱温: 45 °C 流速: 0.6 mL/min 流动相A: 95:5乙腈/水 +10 mM醋酸铵流动相B: 50:50乙腈/水 +10 mM醋酸铵梯度: 流动相B在2 min内从0.1%升至20.0%,然后在3 min内从20%升至80%,随后重新平衡3 min 运行时间: 8 min 进样体积: 1 µL MS条件 MS系统: Xevo TQ-S micro、Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S 电离模式: ESI (+) 毛细管电压: 2.8 kV (+) 采集模式: MRM 离子源温度: 120 °C 脱溶剂气温度: 500 °C 锥孔气流速: 150 L/h 脱溶剂气流速: 1000 L/h 雾化气: 7 bar 离子导入装置偏移1: 3 V 离子导入装置偏移2: 0.3 V

信息学软件创建LipidQuan Quanpedia方法文件(1.4版),其中包含LC条件、MS方法以及相关的TargetLynx处理方法(包括保留时间和 MRM通道)。使用TargetLynx或Skyline(华盛顿大学MacCoss 实验室软件)处理所得数据。

结果与讨论 LipidQuan使用正离子模式MRM对人血浆中的Cer和HexCer类物质进行定性和定量,同时还能分析其它脂类,如TG、PC、 SM。在HILIC分离条件下,Cer在溶剂前沿洗脱(大约0.4 min 处),HexCer和SPH类脂质洗脱为分离的峰(大约0.8-1.1 min 处),如图3所示。总共分析了24种Cer、23种HexCer和SPH。得益于该方法的灵敏度,使用50 µL血浆可轻松检测出人血浆中正常循环水平的这些脂质,其线性动态范围覆盖4个数量级。此处讨论的Cer和HexCer脂质通道使用的是脂质母离子及其特征长链碱基(LCB)子离子(m/z 264)(图1)。通道列表见表1和表2。使用萃取前加标已知浓度SIL标准品的血浆样品制备标准曲线用于定量分析。采用相同条件制备和分析内源性脂质的替代标准品,对同类内源性脂质进行了定量分析。使用市售的预混合SIL 溶液而非每种待测脂质的SIL,可以显著降低大规模研究的总体成本。SIL标准品C16神经酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0)、C18神经酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)和C24神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0)的标准曲线示例如图4所示,可用于定量内源性的Cer和HexCer。使用氘代CERAMIDE LIPIDOMIX SIL标准品绘制标准曲线时,若典型R2 值> 0.95,且与拟合直线的偏差(CV) < 30%,则视为标准曲线可接受。C24:1神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1)的标准曲线不符合此标准。由于事先已开发好LipidQuan Quanpedia方法文件,用户只需下载用于分析Cer和HexCer脂质类别的MRM通道和色谱条件即可,无需手动输入LC-MS方法,因此避免了可能出现的抄录错误

 

 

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