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中药中齐墩果酸和熊果酸的准确定量分析-高分辨率采样二维液相色谱

发布时间:2020-12-10   点击次数:756次

摘要: 质量控制是中药 (TCM) 行业中重要的任务之一。在质量控制中,要求用 HPLC 方 法测定 TCM 中主要化合物的含量。鉴于 TCM 样品的复杂性,目标化合物有可能与 其他微量化合物在 HPLC 分离中发生共洗脱。二维液相色谱是一个采用正交色谱柱 化学键合相和流动相的强大方法,该方法可分离复杂样品。本应用简报详述了如何 开发用于翼首草 (Pterocephali Herbra) 中齐墩果酸和熊果酸定量分析的高分辨率采样 二维液相色谱方法。

 

前言 中药 (TCM) 分析是一项挑战的任 务,因为无论是一种草药还是复方制剂, 含有的成分都非常复杂。为控制 TCM 的 质量,需要使用《中国药典》(CHP) 中规 定的 HPLC二维液相色谱 方法测定其中主要化合物的含 量。通常来说,其他化合物将与目标化合 物发生共洗脱,从而影响定量准确度。 在《中国药典》中,翼首草是一个需要 用 HPLC 方法测定齐墩果酸和熊果酸(图 1)两种目标化合物含量的示例。本研究 发现,其他几种化合物会与齐墩果酸和熊 果酸发生共洗脱,使现有方法不足以对这 些化合物进行定量分析。

 

 为实现正交分离,本应用简报使用两根选 择性不同的 Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱(EC-C18 和 Phenyl-Hexyl), 并在高分辨率采样二维液相色谱中采用了 不同的流动相条件。在选定时间范围内收 集几个涵盖一维色谱图中整个峰面积范围 的小体积馏分,以此测定两个目标化合 物。每次切割都驻留在采样环中,并在第 二维中对所有切割进行连续分析。这一模 式可确保所有选定化合物均转移至第二 维,并在其中得到分析。因此,选定的共 洗脱化合物都接受了高分辨率采样处理, 以在第二维中得到分析。如之前出版的技 术概述1 所示,这一操作可实现可靠的定 量分析。

 

实验部分 化学品和样品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级。乙腈和 甲醇购自 JT Baker, USA。乙酸铵购自 北京百灵威科技有限公司。新制超纯 水产自 ELGA 水纯化系统,Lane End, UK。翼首草提取物以及齐墩果酸和熊 果酸对照品由中国当地一家制药公司提 供。将齐墩果酸和熊果酸同时溶于甲醇 中配制储备标准溶液,二者浓度分别为 2.3 mg/mL 和 2.0 mg/mL。 仪器 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱包括 以下模块: • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B),配备样品冷却装置(选 件 #100) • 两台 Agilent 1290 Infinity II MCT (G7116B) • 两台 Agilent 1290 Infinity II DAD (G7117B),配备 10 mm 大光强 卡套式流通池 (G4212-60008) 和 60 mm 大光强卡套式流通池 (G4212- 60007) • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A) 和 2 位/4 通双向阀(二维 液相色谱阀头,G4236A) • 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A),配备带 40 µL 定量环的 多中心切割阀 (G4242-64000) 

 

 高分辨率采样方法设置 高分辨率采样方法设置参考了之前发布 的技术概述1 。图 3 显示 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱的高分辨率采样配 置,包括 2 位/4 通双向阀,与带有 12 个 定量环的多中心切割阀相连。采用这一设 置后,多可对 10 次连续切割进行采样 与储存以待分析。对于高分辨率采样,为 避免发生任何样品损失,建议定量环充填 量大为 80%。图 4 显示了二维泵的使 用方法设置。首先,运行一维液相色谱分 离样品,并将色谱图加载为参比信号预览 窗口。基于时间高分辨率采样以目标峰为 依据,8 次切割涵盖了整个峰宽。在给定 一维条件下,采样时间为 8.63 秒,相当 于 72% 的定量环填充。

 

结果与讨论 分离 图 5 显示采用根据 CHP 方法的优化方 法,对翼首草中的齐墩果酸和熊果酸进行 分析得到的典型色谱图。在这一方法中, 采用 InfinityLab Poroshell 120 4 µm 为对 照品提供了良好的分离度,而样品极其复 杂,因此目标分析物未能与其他干扰化合 物实现充分分离。因此,使用传统一维液 相色谱分离无法对目标分析物进行定量 分析。 使用高分辨率采样二维液相色谱可将这两 种目标化合物从干扰化合物中分离,实现 正确的定量分析。利用不同选择性的色 谱柱化学键合相可达到这一目的。在 2.7 和 1.9 µm 表面多孔颗粒填料上引入多 种化学键合相,使 InfinityLab Poroshell 120 色谱柱成为实现二维 HPLC 分离所 需正交分离的选择。该方法使用 Phenyl-Hexyl 色谱柱作为。齐墩 果酸和熊果酸两种目标化合物在 Agilent InfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl, 2.1 × 100 mm, 1.9 µm 色谱柱上实现了 基线分离,如图 6A 所示。亚 2 µm 表面 多孔颗粒填料 Poroshell 色谱柱对两个窄 峰宽化合物表现出高柱效和良好的分离 度,使二维分离采样更轻松。第二维分 离使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 3.0 × 50 mm, 2.7 µm 色谱柱。这 款色谱柱反压低,可采用高流速使目标化 合物与共洗脱化合物实现快速分离。使 用高分辨率采样,对包含齐墩果酸和熊 果酸色谱峰的时间范围进行 8 次切割采 样(图 6A),并进样至第二维进行分析 (图 6D)。

 

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