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如何利用配备二极管阵列检测器的安捷伦高效液相色谱分析吐温 80

发布时间:2020-12-14   点击次数:473次

摘要:吐温 80 通常用作药物中的稳定剂,或用于组织处理的抗钙化剂。吐温 80 是不均匀混合物,且缺乏良好的发色团,定量分析具有挑战性。本研究使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱和 Max Plot 二极管阵列检测器 (DAD) 开发出一种简单快速的安捷伦高效液相色谱 (HPLC) 分析方法,用于分析溶于 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液中的吐温 80。基于吐温 80 洗脱区域中色谱峰的峰面积总和进行定量测定。经方法学评估,其精度、准确度、线性和定量限/检测限实验均得到了可接受的结果。这种方法可用于对含吐温 80 的各种水溶液进行质量控制和稳定性监测。

 

前言:吐温 80 也称为聚山梨酯 80,是一种常用的非离子表面活性剂、乳化剂、稳定剂和增溶剂,广泛用于药物、食品、化妆品、维生素、疫苗、静脉制剂、洗剂和肥皂中。在蛋白质制剂中,吐温 80 及其他聚山梨酯可大程度减小表面吸附,降低蛋白质变性的速率,并提高药物的溶解性和稳定性。吐温 80 也可用于心脏瓣膜组织制备中,戊二醛前、后组织处理(固定)的抗钙化剂1 。鉴于这些关键作用,需要准确定量吐温 80 以确保产品质量。吐温 80 是脂肪酸(主要是油酸)偏酯与山梨糖醇及其酸酐乙氧基化(每摩尔山梨糖醇和山梨酸酐用 20 摩尔左右环氧乙烷进行乙氧基化)的混合物。图 1 示出其分子结构。作为大分子化合物,由于混合物不均匀且缺乏紫外发色团,因此难以对聚山梨酯进行定量分析。文献中描述了聚山梨酯 80 的几种定量分析方法。已经报道了基于聚山梨酯 80 化学转化的间接方法,如碱诱导水解成油酸2,3。这些方法费时费力,包括在 40 °C 至 60 °C 的高温下消解 6 至 18 小时。也有将 HPLC 分离与不同检测方法(如蒸发光散射检测 (ELSD)4–6、电喷雾检测 (CAD)7 和质谱 (MS)8 )联用,开发出几种吐温 80 的直接分析方法。一些研究人员试图不分离并用单一色谱峰进行定量分析4,9。这些方法可能需要复杂的仪器,而且可能无法用于监测吐温 80 溶液的稳定性。本研究介绍了一种用于测定水溶液中吐温 80 的简单快速的方法,该方法基于 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱和二极管阵列检测器进行反相 HPLC 分离。通过测试其专属性、线性、精度、灵敏度和准确度来评估该方法用于测定磷酸盐缓冲液中吐温 80 的适用性。这种方法为科学家提供了一种理想选择,因为二极管阵列检测器比 ELSD、CAD 和 MS 检测器更常用于 HPLC 分析。

 

实验部分:材料和仪器吐温 80 标准品购自 US Pharmacopeial Convention (Rockville, MD)。利用购自 Fisher Chemical (Fair Lawn, NJ) 的吐温 80 配制吐温 80 样品。乙腈(HPLC 级)、磷酸二氢钠二水合物(经认证的晶体)、磷酸氢二钠二水合物(经认证的晶体)和磷酸 (> 85%) 购自 Fisher Chemical。水采用 Milli-Q 水纯化系统 (Millipore, Bedford, MA) 制备得到。将 HPLC 系统与二极管阵列检测器 (DAD) 联用,对吐温 80 样品进行分析。利用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 ECC18, 3.0 × 100 mm, 2.7 µm 色谱柱(部件号 695975-302A,安捷伦科技公司,加利福尼亚州圣克拉拉)来洗脱吐温 80 峰。将 DAD 分辨率设置为 1.2 nm,在 195–400 nm 的波长范围内进行扫描。采集 Max Plot 信号进行定量分析。进样量为 20 µL,使用等度流动相运行,其中包括流动相 A(0.1% 磷酸水溶液)和流动相 B(0.1% 磷酸乙腈溶液),A:B 的恒定比例为 20:80。在整个分析过程中,色谱柱保持为 30 °C,流动相流速保持为 0.4 mL/min。

 

结果与讨论:分析的优化文献推荐使用几种 HPLC 色谱柱和流动相(如 HPLC C18 色谱柱)4 ,梯度开始时为 70:30 的水:甲醇,在 4 分钟时改变为水: 甲醇 10:904 。吐温 80 未获得单个峰,也未完全洗脱。使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱和 Max Plot 二极管阵列检测器的上述当前条件,得到一种快速且相对简单的方法来分析磷酸盐缓冲液中吐温 80 的浓度通过对每个时间点处测得的大光谱吸光度绘图,得到 Max Plot 色谱图。Max Plot 色谱图使分析人员能够看到样品中的所有色谱峰,无论 λmax(大吸光度所对应的波长)是多少。图 2 示出溶于 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液中的 USP 吐温 80 标样的 Max Plot 色谱图。吐温 80 的弱紫外吸光度限制了通过固定单波长来分析吐温 80。M. Klein 等人10 使用凝胶过滤色谱 (GFC) 柱和 UV 245 nm 条件分析吐温 80。Klein 方法的灵敏度较差。当我们尝试从 DAD 数据中提取 245 nm 处的色谱图时,获得了出人意料的色谱图。图 3 示出吐温 80 样品的 Max Plot 及其在 245 nm 处提取的色谱图之间的比较。在 245 nm 处提取的色谱图相比原始 Max Plot 色谱图峰数量更少,并且 Max Plot 色谱图中的所有峰在 245 nm 处表现出较弱的紫外吸光度。结果清楚地表明,Max Plot 二极管阵列检测器更适合用于吐温 80 分析。 Max Plot 色谱图中的一个峰或一组峰能否用于吐温 80 的定量分析?对由 USP 吐温 80 标准品和 Fisher 吐温 80 制得的浓度为 10 mg/mL 的吐温 80 溶液的分析结果进行比较,它们的 Max Plot 色谱图分别如图 2 和图 3A 所示。即使吐温 80 的浓度相当(10.033 mg/mL USP 吐温 80 和 10.145 mg/mL Fisher 吐温 80),色谱图在相似保留时间处仍表现出不同的峰强度。

 

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结论:本研究开发出一种简单快速的 HPLC 分析方法,分析溶于 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液中的吐温 80,该方法使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱和 Max Plot 二极管阵列检测器 (DAD)。该方法准确、精密而灵敏。如采用适当的样品预处理,较宽的校准范围可以使该方法应用于各种水溶液(如治疗性蛋白质制剂)。此外,该方法可用于研究吐温 80 溶液的稳定性。

 

 

 

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