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使用液质联用系统分析未衍生化氨基酸的方法

发布时间:2020-12-18   点击次数:365次

摘要 :本应用简报介绍了一种针对未衍生化氨基酸分析优化的方法。 氨基酸的极性使其难以进行反相液相色谱分析。然而,亲水相互作用色谱 (HILIC) 能保留并分离复杂的氨基酸混合物,同时还具有与传统反相色谱类似的工作流程。 HILIC 与质谱的组合提供了一种简单而功能强大的氨基酸分析解决方案。 前言 事实证明,在低 pH 与正离子模式 LC/MS 检测条件下,采用亲水相互作用色谱 (HILIC) 分离未衍生化氨基酸,能够获得整体灵敏度和色谱分离性能。Agilent InfinityLab Poroshell 120 2.7 µm HILIC-Z 和 HILIC-OH5 化学键合相为氨基酸的 LC/MS 分析提供了两个理想选择。二者均可对较 难分离的亮氨酸/异亮氨酸同质异位素以 及多种氨基酸实现完全分离。

 

 实验部分 :试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。超 LC/MS 级乙腈购自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的净化处理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 完成。试剂级甲酸(FA,部 件号 G2453-85060)来自安捷伦科技公 司。甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵和氨基 酸标样购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下储存。 仪器和材料 • Agilent InfinityLab 接头 • 色谱柱前端:InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头 (部件号 5067-5965) • 色谱柱末端:InfinityLab Quick Turn 液相色谱接头(部件号 5067-5966) • 安捷伦样品瓶,螺口盖,棕色,带书 写签,经认证,2 mL(部件号 5182- 0716) • 安捷伦固定螺口盖,带 PTFE/ 红色硅胶隔垫(部件号 5190-7024) • 安捷伦样品瓶内插管,250 µL,去活 玻璃,带聚合物支脚(部件号 5181- 8872) Eppendorf 移液器和连续分液器 • 涡旋器和多管涡旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • HDPE 溶剂瓶 (VWR, Radnor, PA, USA) 仪器 • Agilent 1290 Infinity II 二元泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II 样品瓶进样器 (G7129B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超 低扩散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站软件 • Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统 • 安捷伦喷射流电喷雾离子源样品前处理 将氨基酸标准品与水混合至表 1 所列出 的浓度,无需进一步样品前处理即可直接 分析。 流动相前处理 用水配制 200 mM 甲酸铵储备液,并用 甲酸将 pH 调节至 3。将水与储备液按 9:1 稀释制得流动相 A。将乙腈与储备液 按 9:1 稀释制得流动相 B。两种流动相的 甲酸铵终浓度均为 20 mM。 流动相与玻璃器皿过度接触会引入离子物 质,干扰并抑制质谱检测。储存在玻璃瓶 中的流动相应定期更换,或将玻璃瓶换成 HDPE 瓶。

 

 

 结论 • 使用 HILIC 在正离子模式 液质联用LC/MS 条件 下对氨基酸实现了成功分析 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 显示出更好的总体峰形,对天冬氨酸 和组氨酸等碱性更强的化合物更是 如此 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-OH5 对酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸等早洗脱 峰表现出更高分离度 • 这两种色谱柱对通常难以分析的亮氨 酸/异亮氨酸同质异位素也实现了基 线分离

 

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