技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 >如何采用Ostro 96孔样品制备板提高DBS萃取物的洁净程度

如何采用Ostro 96孔样品制备板提高DBS萃取物的洁净程度

发布时间:2020-12-22   点击次数:277次

引言:干血斑分析法(DBS)在医药行业正变得愈发重要。动物实验所带来的经济及伦理道德方面的问题,以及在运输以及储存生物样品时所产生的高额费用问题,都使得DBS分析法成为一种颇具吸引力的选择。DBS 分析法可取得较高的分析物回收率。然而,该技术在去除内源性干扰方面收效甚微。以残余磷脂(PLs)为主的干扰物是生物分析中遇到的主要问题。而LC/MS/MS系统中PLs的蓄积,则是引发基质效应的主要原因。在所有其他问题之中,基质效应会以无可预测的方式影响质谱响应值,降低分析方法稳定性并增加其可变性。Ostro 96孔样品制备板则可消除99%以上的PLs残留。Ostro 96孔板可通过使用96孔制备板的形式进一步简化DBS萃取流程,同时提取分析物、去除磷脂、过滤干血斑纸片。DBS样品可在孔内萃取并稀释直接进样到LC/MS/MS液质联用系统中。该创新方法能够显著降低样品制备时间,并在萃取转化、干燥、复溶过程中避免潜在的分析物流失。在本应用纪要中,我们同时应用了传统方法和Ostro 96孔样品制备板方法,对含有利培酮、利培酮羟基化代谢物、 9-OH利培酮及其内标氯氮平(图1)的全血样品进行了萃取。

 

实验部分: ACQUITY UPLC条件色谱柱: ACQUITY UPLC BEH C18, 2.1×50 mm,1.7 μm 流动相A: 0.1% NH4OH 水溶液流动相B: 50/50 ACN/MeOH 流速: 0.6 mL/min 梯度: 时间 梯度模式 梯度线型 (min) %A %B 0.0 75 25 6 2.0 0.5 99.5 6 3.0 0.5 99.5 6 3.1 75 25 6 3.5 75 25 6 进样量: 40 μL 进样模式: 部分环进样柱温: 35 ℃ 样品温度: 15 ℃ 强洗针液: 60:40 ACN:IPA+2% HCOOH 弱洗针液: 95/5 H2O/MeOH 沃特世Xevo TQ-S MS运行条件,ESI + 毛细管电压: 3.0 V 脱溶剂温度: 550 ℃ 锥孔气流速: 150 L/Hr 脱溶剂气流速: 1000 L/Hr 碰撞池压力: 2.6×10(-3) mbar MRM通道监测,ESI+参见表1

样品制备条件将20 μL的全血样品滴在未经处理的Whatman DMPK-C血卡上。样品随后在室温下干燥2小时。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm 血斑,分别放置进传统型DBS 萃取法所需的1.5 mL离心管和 Ostro 96孔板孔中。传统萃取方法在1.5 mL离心管中进行,使用了250 μL含5%水的甲醇溶液,随后样品进行1分钟涡旋、1分钟3000 g离心,并终将萃取物转移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取则采用单步孔内萃取法。在Ostro 96孔板中添加 3 mm干血斑(图2)。以250 μL 含5%水的甲醇溶液作为萃取溶液,涡旋操作1分钟、真空操作5分钟。两种方法产生的洗脱液都用 250 μL 的水进行稀释,然后进样到LC/MS/MS系统中。

 

结果与讨论:在正离子模式下进行MS分析。鉴于DBS萃取物的直接进样通常会导*稀释的样品,我们采用 Xevo TQ-S以显著提升系统的灵敏度。这同时也有助于直接进样,并避免了吹干、复溶过程中可能存在的问题。针对每一种样品制备方法,我们都比较了磷脂残留量。为了达成这一目的,我们对单个试管萃取和使用Ostro PLR板孔内萃取的DBS进行了比对,对五种磷脂进行了量化。与传统型DBS分析法相比,Ostro板去除磷脂比例高达99.9%(图3)。为能直观展示残余磷脂,传统型DBS萃取法和使用 Ostro的孔内DBS萃取法所产生的五种不同磷脂的总离子流(TIC)如图所示(图4)。当使用Ostro板时,磷脂残留量几乎可忽略不计,且无蓄积情况。而当使用传统型DBS法时,即便出于预防磷脂蓄积的目的,采用高比例有机溶剂进行了1分钟的清洗,磷脂残余量依旧显著,而且在整个过程中都有蓄积。我们进行了半验证,计算QC样品浓度不足预期值的15%,满足法规标准。9-OH利培酮(图6)及其母化合物LLOQ在全血中都达到 0.05 ng/mL。标准曲线在3个以上数量级呈线性,全血中的线性范围从0.05 ng/mL到50 ng/mL(图7)。

 

结论 ■ 简便、单步的DBS样品制备方法 ■ 相较于传统的DBS萃取技术,去除残余磷脂含量高达99.9% ■ 采用Xevo TQ-S三重四级杆液质联用质谱仪,获得高灵敏度 ■ 去除LC色谱柱中PLs的蓄积

 

在线咨询
在线客服
咨询热线

18602175640

[关闭]