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超高效二维液相色谱法准确测定连翘中的连翘酯苷A和连翘苷

发布时间:2021-03-02   点击次数:231次

摘要 :本文参照 2015 年版《中国药典》,采用多中心切割超高效二维液相色谱法分析 连翘提取物中的连翘苷和连翘酯苷 A。在二次分离过程中,目标化合物和干扰 物质进一步有效分离,使得测定结果更加准确。由实验结果得到,连翘酯苷 A 在 0.05-0.4 mg/mL 浓度范围内线性相关系数 R2 = 0.9958 ,连翘苷在 0.01-0.2 mg/mL 浓度范围内线性相关系数 R2 = 0.9999;0.1 mg/mL 混合对照品溶液连续进样 6 次 考察峰面积重现性,连翘酯苷 A 的 RSD 为 4.2%,连翘苷 RSD 为 0.3%。

 

前言:中药材、中药提取物和中成药的质量优劣多根据现行《中国药典》中相关品种 的分析方法来判断。高效液相色谱法是中药中有效物质或有毒有害成分常用的检测方法。随着《中国药典》的不断更新,其中的高效液相色谱方法的数量 也在不断增加。然而,由于中药成分的复杂性,很多药典方法存在峰型差、分 离度不好等问题,不利于准确的定量分析。 连翘,又名旱莲子、大翘子,为木犀科植物连翘的干燥果实。2015 年版《中国 药典》[1] 分别收载了连翘药材和提取物两个品种,药材采用两个等度方法分别 测定连翘苷和连翘酯苷 A,提取物采用特征图谱方法同时测定连翘苷和连翘酯苷 A。本文参照 2015 年版《中国药典》,采用多中心切割超高效二维液相色谱[2-7] 方法对连翘提取物中连翘苷和连翘酯苷 A 进行分析,此方法大程度降低目标 化合物受其它成分的干扰,使其定量结果更加准确。

 

 实验部分: 试剂和样品 乙腈、甲醇和磷酸为色谱纯级,购自 Sigma-Aldrich;水为 Mill-Q 纯水机新制超纯水;连翘酯苷 A 和连翘苷对照品、 连翘提取物为企业友情提供。 仪器和设备 本文采用 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱系统,其含有: • 1290 Infinity Ⅱ 二元泵(部件号 G7120A,内置四通道脱 气机) • 1290 Infinity Ⅱ 自动进样器(部件号 G7167B) • 1290 Infinity Ⅱ 柱温箱(部件号 G7116B) • 1290 Infinity Ⅱ 二极管阵列检测器(部件号 G7117B) • 1290 Infinity Ⅱ 二元泵(部件号 G7120A,内置四通道脱气 机),用于第二维分析 • 1290 Infinity Ⅱ 二极管阵列检测器(部件号 G7117B),配 60 mm 高灵敏度流通池(部件号 G4212-60007),用于第二 维检测 • 外置阀驱动(部件号 G1170A),3 个 • 多中心切割二维液相升级包(部件号 G4242A) • OpenLab CDS ChemStation 软件(修订版 C01.07[27]),用于 系统控制及数据处理 • 二维液相色谱采集软件(部件号 G2198AA):用于多中心 切割方法编辑及数据分析 系统配置及工作原理 系统配置及连接如图 1 所示。样品先经第yi维色谱柱分离 后,目标化合物通过检测器后的双 2 位 4 通阀的切换进入 6 位 14 通阀所连接的样品环,可以根据第yi维峰宽对目标 峰进行连续多次收集。第yi个样品环收集完成后,即刻自 动触发第二维的分析。同时,样品环还可继续收集第yi维 其它组分。

 

 对照品溶液和供试品溶液的配制 对照品溶液:精密称取连翘苷和连翘酯苷 A 对照品各 40.0 mg 于 100 mL 容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即 得 0.4 mg/mL 混合对照品溶液。将该溶液用甲醇逐级稀释成 0.2、0.1、0.05、0.01 mg/mL 溶液,用于建立校准曲线。 供试品溶液:精密称取连翘提取物 50 mg 置于 10 mL 容量 瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀后,取 2 mL 溶液于高速离 心机,以 10000 rpm 离心 10 min,取上清液过 0.22 µm PTFE 滤膜过滤,待测。 多中心切割超高效二维液相色谱条件 多中心切割超高效二维液相色谱方法包括三部分,第yi部分 为第yi维 UHPLC 方法,第二部分为阀切换次数和时间,第三 部分为第二维 UHPLC 方法。其中,第yi部分由 OpenLab CDS ChemStation 设定,包括泵、自动进样器、柱温箱和检测器参 数,第二和第三部分由内置于 OpenLab CDS ChemStation 的二 维液相色谱采集软件编辑完成。整个分析时间为 30 min。

 

结果与讨论: HPLC 转换为 UHPLC 2015 年版《中国药典》中连翘提取物的分析方法为 HPLC 方法,参考该方法一次运行时间约为 80 min。按照相同填 料和两倍线流速原则,可将 80 min 方法转换为 18 min 的 UHPLC 方法,如图 2 所示。综观 HPLC 和 UHPLC 色谱图, 两种方法的分离谱图相似,且 UHPLC 时间的缩短并未损失 HPLC 获得的分离度,如 HPLC 色谱图中连翘苷出峰前的干 扰峰在 UHPLC 上也得到明显分离。

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