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使用液质联用方法定量分析血清中的睾酮

发布时间:2021-03-17   点击次数:355次

摘要:目前需要通过一种超高灵敏度的定量分析方法来测定男性体内总睾酮和游离 睾酮的浓度,尤其要能够测定女性和儿童体内的低浓度睾酮。因此,安捷伦 开发了一种使用 Agilent 6495 离子漏斗质谱仪定量分析和表征血清中睾酮的 分析方法,同时确定了适合实验室使用的分析方法。

 

前言:睾酮 (T) 是一种促进男性生殖器发育 的雄性激素,与女性的雌性激素前体 类似,它可以影响男性的第二性征。 它可以发挥同化作用,并对两性行为 产生影响。循环睾酮可与性激素结合 球蛋白 (SHBG) 结合,其中小部分与白 蛋白结合,另一小部分以游离激素形 式存在。非 SHBG 结合的游离睾酮是 生物活性成分,因为与血清白蛋白结 合的睾酮可以自由离解。 实验部分 化学品与试剂 用于基质匹配校准物的人血清购自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 标样和内标购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)。样品前处理和液相色谱溶剂购 自 Burdick & Jackson (Morristown, NJ)。

 

 样品前处理 根据以下步骤配置样品、校准物和基 质中的质量控制 (QC) 物质。 1. 将 100 µL 样品和 5 µL 5 ng/mL 内标 置于试管中 2. 向每个试管中加入 2 mL HPLC 级的 3:2 乙酸乙酯/己烷,并涡旋混合 2 分钟 3. 将有机层转移至另一洁净试管, 并加入 500 µL 0.1 mol/L NaOH 溶液 4. 在室温下收集有机层并在氮气下 吹干 5. 干燥后,将样品复溶于 100 µL 70:30 的水/甲醇中进行分析数据分析 采用 Agilent MassHunter 采集软件 (B.07) 进行系统控制和数据采集。采 用 Agilent MassHunter 定量分析软件 (B.07) 对数据进行分析。

 

结果与讨论 线性 采用线性回归拟合和 1/x 的加权因子得 到了不包括原点在内的校准曲线,从 而确定了总睾酮在 1-1000 pg/mL 浓度范 围内的相关系数 (R2 ) 平均值大于 0.998 (图 1)。根据 10:1 的信噪比 (S/N) 测定 得到定量限 (LOQ) 为 5 pg/mL。 准确度和精度 本研究得出了出色的结果,结果汇总 如表 1 所示。在 4 天的单次运行中, 对六种浓度的 QC 样品进行五次分析。 表 1 显示了每日的准确度和整体精 密度。所有 QC 样品的准确度为 75%- 125%,精密度 < 13%。方法对比 将 LC/MS/MS 分析方法与经过预先验 证的 ELISA 方法相比,以确保结果的 准确性。采用 LC/MS/MS 分析方法和 ELISA 方法提取并分析二十五份机密 的患者样品。表 2 列出了通过这两种 方法得到的结果 (ng/dL) 和百分比差 异。如图 2 所示,R2 > 0.96。

仪器对比 使用两台 Agilent 6495 三重四极杆 LC/MS 仪器分析相同样品并对比结 果。如图 3 所示,R2 值 > 0.96。

 

结论 这些数据表明,该提取流程和 LC/MS/MS 分析方法可用于对低浓度 总睾酮进行所需的定量分析。所购买 基质材料中的低浓度睾酮和其他干扰 化合物成为了限制因素,阻碍了该分 析方法检测低浓度的睾酮。校准曲线 获得了出色的线性,并得到了高度重 现、准确而数据。 

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