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LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响--选择最佳色谱柱规格

发布时间:2021-07-05   点击次数:165次

简介:过去,体积排阻色谱(SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用广泛的方法1 。但近年来,由于SEC色谱柱和LC 系统的性能提升,使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中受关注的, 是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法2 。相较于将 单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分 离方法,LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主 要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小 (流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗 脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱,使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 µm的SEC色谱柱能够提高效率,从而提高HMWS和LMWS 的分析通量,但由于色谱柱硬件和填料的限制,这些高柱效SEC颗粒仅适用于内 径为4.6 mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时,通常因为SEC粒径为3 µm 及以上,可以选择7.8 mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6 mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行,但存在一个经常被忽视的事 实,即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体 积,导致观察到的峰分离度明显降低3 。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色 谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

 

本研究的目的是系统性评估SEC粒径、色谱柱柱长和内径以及LC系统柱外扩散对mAb的HMWS和LMWS的分离度的影响,文中所述 基本原理适用于其它蛋白质的SEC分析。此外,还将演示系统扩散对LMWS的检测下限和定量结果可靠性的不良影响。综上,提供与 Waters™ LC液相色谱仪器兼容的色谱柱的选择建议。

 

测定系统扩散:色谱分析的一条基本原理是:色谱柱以外发生的柱外扩散或柱外色谱峰/谱带展宽始终会对分离度造成不良影响。在许多蛋白质和肽的 梯度分离(例如反相和离子交换)中,分析物在上样条件下与固定相强力结合,并在柱床的头部重新浓缩,然后开始梯度洗脱。这些梯度分 离方法,能够大程度削弱甚至消除柱前谱带扩散造成的不良影响,使分析人员的主要关注点转向峰从色谱柱洗脱后发生的扩散。与此 相反,在理想的SEC分离中,蛋白质样品和SEC颗粒表面不发生结合。对于SEC分离的实际情况是,柱前扩散与柱后扩散一样会降低分离 质量。因此,评估样品在通过不含色谱柱的LC系统后体积和曲线的变化可能十分有用。

 

柱外扩散(系统谱带展宽)的测定已得到广泛研究。 感兴趣的读者可以参阅本应用纪要的姊妹篇《评 估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》 (沃特世应用纪要,部件号:720006337ZH),其中 更全面地讨论了系统扩散及其测定,并额外展示 了有关柱外扩散对SEC分离影响的实验。本文测 定了5σec扩散体积(根据4.4%峰高处峰宽),如图1 所示。从图2所示扩散曲线可见,柱外扩散峰不对 称(曲线存在明显的拖尾或偏斜),因此峰宽测定位 置越接近基线,受峰拖尾的影响可能就越大。因 此,选择使用4.4%峰高处峰宽来测定5σ峰值虽然 有些武断,但这是大多数常用色谱数据系统(例如 Waters Empower 3和Agilent ChemStation)所提 供的峰高百分比处的峰宽。通过在色谱柱入口 侧增加样品定量环,ACQUITY UPLC H-Class Bio系统上发生的各种柱外扩散情况如图2所示

 

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