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使用Agilent Cary 3500测定丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度

发布时间:2021-07-14   点击次数:155次

前言:酶催化活性浓度测量是医学参考实验室的基础检测项目。目前,国际检验医学溯源联合委 员会 (JCTLM) 已批准由国际临床化学和实验室医学联盟 (IFCC) 编写的七种酶(L-丙氨酸 氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、乳酸脱氢酶 (LDH)、α-淀粉酶 (AMY)、 肌酸激酶 (CK)、γ-谷氨酰转肽酶 (GGT) 和碱性磷酸酶 (ALP))的参考方法,即《IFCC 在 37 °C 酶催化活性浓度测量的原级参考方法》。 本研究参照《IFCC 在 37 °C 酶催化活性浓度测量的原级参考方法 第 4 部分:丙氨酸氨基 转移酶催化浓度测定参考方法》[1],使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计对丙氨 酸氨基转移酶 (ALT) 的催化活性浓度进行监测。该方法中的基本原理是:在 37 °C 的恒温 条件下,L-丙氨酸与 2-酮戊二酸在 ALT 的催化下生成丙酮酸和 L-谷氨酸,丙酮酸与烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸和 NAD+ (如以下反应方程式所 示);然后通过监测 339 nm 下 NADH 的氧化速率(即吸光度的下降速率)来测定丙氨酸 氨基转移酶的催化活性浓度,二者呈正比关系。 L-丙氨酸 + 2-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸 丙酮酸 + NADH + H+ LD 乳酸 + NAD+


丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度测量 本研究采用配备八池四温区控温附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计进行测 试,仪器的精准控温功能可以保证每个池位中样品的温度均可以满足 IFCC 规定的 37.0 ± 0.1 °C 的控温要求。实验样品采用标准物质 GBW(E)090282a、GBW(E)090283a 以 及 IFCC 组织的 2020 年度参考测量实验室外部质量评价计划 (RELA) A、B 样本。

基本操作流程如下: 1) 确认测量条件合格(仪器、试剂和环境条件) 2) 打开分光光度计及辅助设备 3) 监测比色杯内温度达 37.0 ± 0.1 °C 4) 准备试剂和分析溶液,并孵育反应液试剂达 37 °C 5) 在比色杯内加入 2 mL 反应液和 0.2 mL 分析溶液,充分混匀 6) 孵育 5 分钟达 37 °C,加入 0.2 mL 起始反应液,充分混匀,并 延迟 90 s 7) 监测吸光度读数 180 s 在正确度验证实验中,检测标准物质 GBW(E)090282a 和 GBW(E)090283a,每份样本检测 3 次,计算均值,比较其是否在 标物的靶值 ± 不确定度范围内;检测 IFCC 组织的 2020 年 RELA 样本 A 和 B,每份样本检测 3 次,计算均值是否在其等效限内。 结果均列于表 1 中。从中可以看出,所得结果均符合等效限的要 求,表明该方法具有良好的正确度。

 

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使用配备八池四温区控温附件的 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计测定酶催化活性浓度,在人员和试剂等因素稳定的前提 下,能够满足科研和常规测量工作的要求。与传统的紫外可见分光光度计配置的水控温/半导体控温附件相比,Cary 3500 UV-Vis 八池四温区控温附件在酶催化反应测试领域中具有以下明 显优势:


1) 温度是酶催化反应过程的重要影响因素。IFCC 参考方法要求将 实验温度控制为 37 ± 0.1 °C,如果温度控制失败会造成实验结果 错误及昂贵样品的浪费。传统多池控温附件很难将所有池位的温 度差控制在 ± 0.1 °C,所以经常当作单池使用或者挑出温差小的 部分池位(2 至 3 个)使用,操作繁琐,实验效率低。Cary 3500 UV-Vis 的八池四温区控温附件,每两个池位由一组控温模块独 立控制,相当于同步运行四台单独的控温设备。通过软件参数设 置,可将每个池位温度控制在 IFCC 要求的 37 ± 0.1 °C 区间内, 同步完成四个样品的测试,对于酶参考实验室进行国际比对工作 的高通量样品测试需求具有重要的意义 2) 传统的控温附件采用水浴循环的方式控温,噪声大且温度升 降的缓冲时间较长,每次实验前需要留出一定的时间 (> 30 min) 等待温度平衡。Cary 3500 UV-Vis 采用空冷控温,升温速度快, 5–10 min 即可实现温度平衡。且无需水浴,避免了实验室噪声以 及水浴长菌的困扰,用户体验度更佳 3) 与此同时,Cary 3500 UV-Vis 采用氙灯光源,光源寿命为 20000 小时以上,控温模块采用全新的一体式设计,无任何移动 部件。因此仪器无需任何维护,用户维护成本低


参考文献 1. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Scientific Division, Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE). IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C: Part 4. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alanine Aminotransferase

 

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