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Agilent 1290生物液相色谱系统进行高分离度 SEC 分析

发布时间:2021-08-24   点击次数:384次

摘要:本应用简报介绍了配备 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱和超低扩散毛细管的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统通过体积排阻色谱 (SEC) 分离蛋白质的出色分离 度。生物兼容性 UHPLC 系统能够使用腐蚀性盐缓冲液进行分析,因此节省了维护 费用。比较了不同内径毛细管(0.17、0.12 和 0.07 mm)在 SEC 分析中的分离度。 对一种蛋白质混标和单克隆抗体 (mAbs)(包括聚集体)进行了分离,并比较了分离 度。此外,由单一软件解决方案中的 Agilent OpenLab GPC/SEC 附加软件确定了分 子量,实现了一步式工作流程。


前言:mAbs 等现代生物药物是高度异质性的化 合物。聚集体是最重要的关键质量属性 (CQAs) 之一,通常采用 SEC 进行监测。 这项技术可根据标准品计算待测物分子 量,从而对化合物进行鉴定。此外,该技 术还可通过显示更高分子量的聚集体成分 (如二聚体和更高程度聚集体)来确认纯 度。为获得足够的分离度,推荐使用亚 2 µm 颗粒填充的现代 SEC 色谱柱。为 实现最佳性能,亚 2 µm 色谱柱和死 体积尽可能小的 UHPLC 仪器。死体积过 大会因扩散效应而损失这些色谱柱获得 的分离度。此外,完全生物兼容的 1290 Infinity II 生物液相色谱系统可以应对 SEC 缓冲液中常用的高浓度盐,以维护成本提供可靠结果。 本应用简报介绍了现代亚 2 µm SEC 色谱 柱在 1290 Infinity II 生物液相色谱系统上 的应用,展示了使用死体积极小的仪器带 来的优势。为证明死体积对蛋白质和聚集 体分离的影响,使用了不同内径的毛细 管。将特征明确的 NISTmAb 通过 pH 诱 导和热诱导产


实验部分 仪器 • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A),配备集成 式样品恒温箱(选件 #101) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B),配备生物兼容性热交换器 • Agilent 1290 Infinity II 可变波长检测器 (G7114B),配备生物兼容性微量流通 池,3 mm,2 µL 其他部件 Agilent 1290 Infinity II 生物超低扩散工具 包 (G7132A#006) 软件 Agilent OpenLab 2.5 版和 GPC/SEC 附加 软件 1.2 版

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色谱柱 Agilent AdvanceBio SEC 200 Å, 4.6 × 300 mm, 1.9 µm (部件号 PL1580-5201) 样品 • 校准用蛋白质混标(部件号 5190- 9417):甲状腺球蛋白 (670000 Da)、 γ-球蛋白 (150000 Da)、卵清蛋白 (45000 Da)、肌红蛋白 (17000 Da)、 血管紧张素 II (1000 Da) • 人源化单克隆抗体 (mAb) 曲妥珠单 抗(商品名为赫赛汀)购自 Roche (Basel, Switzerland)。曲妥珠单抗溶于 30 mmol/L 磷酸盐缓冲液中,pH 6.8 • Agilent NISTmAb,人源化 IgG1κ mAb (部件号 5191-5745)


pH 诱导/温度诱导 NISTmAb 方案 使用流动相将 mAb 稀释至 2 mg/mL 的最 终浓度。pH 诱导方法与其他文献所述基 本相同,仅有略微改动[1]:将 1 mol/L HCl 溶液缓缓滴加到样品溶液中,使其 pH 值 从 6.0 改变为 1.0。然后,滴加 1 mol/L NaOH 溶液将 pH 值调节至 10.0。最后, 再次滴加 1 mol/L HCl 溶液将 pH 值调回 6.0。pH 值变化间大约有 1 分钟的等待时 间,期间持续缓慢搅拌溶液。将所得溶液 在 60 °C 下温育 60 分钟。 溶剂和化学品 • PBS:在 25 °C 下将 1 片 PBS 片溶于 200 mL 去离子水,得到 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液、0.0027 mol/L 氯hua钾、0.137 mol/L 氯化钠,pH 7.4 • 化学品购自德国 VWR 公司 • 新制超纯水产自配置 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统


结果与讨论 用于蛋白质 SEC 分离的现代色谱柱中填 充亚 2 µm 颗粒,可实现最佳分离。而这 需要仪器具有优化的低死体积,因为高死 体积特别是内径较大的毛细管会损失获得 的分离度。1290 Infinity II 生物液相色谱 系统对 5 种蛋白质混标(包括 3 种二聚 体)的分离结果如图 1A 所示。为了降低死体积和扩散效应,我们使用了 内径 0.07 mm 的毛细管进行分离。早洗 脱的甲状腺球蛋白二聚体 (4.947 min) 实 现了部分分离。如需设置用于分子量测定 的校准,使用该混合物中的所有蛋白质生 成校准曲线(图 1B)。获得了四阶最佳曲 线拟合。

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