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Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计用于蛋白质分析的优势

发布时间:2021-09-23   点击次数:120次

前言:紫外-可见分光光度计测量为样品的质量控制检查提供了一种快速可靠的方法。它们 还可用于计算比活性或估算纯化后的产率,并鉴定含有蛋白质和氨基酸的组分。 含有芳香侧链氨基酸的蛋白质,在接近 280 nm 处产生吸收。因此可以使用紫外-可 见分光光度计进行定量分析。当吸收系数已知时,可根据比尔-朗伯定律 (1) 确定含 有这些氨基酸的蛋白质的浓度。通常蛋白质的样品量有限,以最少体积进行测量对 于样品的保存至关重要。通过波长扫描可提供潜在污染物的信息。 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计具有光学准直的集成式多池支架,与超微 量比色皿(图 1)配合使用,非常适用于可靠且可重现的定性及定量测量。

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本研究展示了Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计在小体 积蛋白质样品定性和定量分析方面的优势。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 是常用的蛋白质标准品,其吸收 系数已知,我们将其用于本分析中。


实验部分 样品 配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS)。配制 10 mg/mL BSA 储备液,并稀释至 0.75、1.50、2.25、3.00 和 3.75 mg/mL。 使用六个孔径为 2 × 2.5 mm,容积 70 µL,光程 10 mm 的超 微量比色皿进行测量(图 1)。其中,一个作为参比,五个作 为样品。使用 3.5 mL、10 mm 光程的标准石英比色皿进行重 现性测量。采用 PBS 缓冲液作为参比溶液。 仪器和方法 所有测量均使用 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计。在 250–350 nm 范围内进行波长扫描,信号采集平均时间为 1 秒, 数据间隔为 1 nm。无需预先校准系统。为证明重现性,用超微量比色皿 (70 µL) 重复测量 3.0 mg/mL BSA 溶液 20 次,其中参比位置为装有 PBS 缓冲液的相同超微 量比色皿。此外,使用 3.5 mL、10 mm 光程的标准石英比色 皿对同样的溶液进行另外 20 次重复测量,以装有 PBS 缓冲液 的相同比色皿作为参比。这些测量均在 278 nm 处进行,信号 采集平均时间为 1 秒,光谱带宽为 2 nm。


结果 同步测量 空白样品和五种浓度 BSA 样品在 Cary 3500 多池紫外-可见 分光光度计中使用超微量比色皿(2 × 2.5 mm 孔,10 mm 光 程)进行同步测量。在 250–350 nm 范围内进行波长扫描以 定性分析样品(图 2)。然后将这些数据用于评估仪器的线性 (参见下文微量池部分中的线性)。

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蛋白质纯度 350 nm 处的吸收强度可用于定量和校正存在于蛋白质样品中 的任何污染物。从图 2 可以看出,该测量样品在 350 nm 处的 吸光度为 0 Abs。因此,这些样品中 BSA 的浓度与光谱图的峰 最大值成正比,根据这一关系可准确测定 BSA 的浓度。无需 杂质校正。 微量池线性 很明显,每个 BSA 波长扫描的峰最大值均出现在 278 nm 处 (图 2)。使用 Cary 紫外工作站软件提取每个样品在 278 nm 处峰的吸收强度,并将其对每种所测样品中的蛋白质浓度作图 (图 3)。这些数据清晰地展示了 Cary 3500 系统的线性 (图 3)。结果表明,线性范围扩展至接近 2.5 Abs,即使使用 小孔超微量比色皿也是如此。

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重现性 为证明重现性,在 70 µL、2 × 2.5 mm 孔径的超微量比色皿或 3.5 mL 标准比色皿中重复测量 3.0 mg/mL BSA 样品 20 次。 两种比色皿的光程均为 10 mm。超微量比色皿较小的窗口孔 径尺寸对测量的重现性(标准偏差)无影响,如图 4 所示。 70 µL 超微量比色皿的测量标准偏差为 0.00042,3.5 mL 标准 比色皿为 0.00029。使用超微量比色皿测得的吸光度平均值为1.863 Abs。使用 3.5 mL 标准比色皿测得的吸光度平均值为 1.858 Abs。两种比色皿所得结果的差异在仪器的测量不确定 度范围内。

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使用小体积比色皿的风险在于较小的比色皿窗口(通常为比色 皿设计的一部分)孔径导致光通量减小。光通量减少会使线性 吸光度范围和测量重现性降低。Cary 3500 具有高度聚焦的光 束,可确保以最大光通量通过样品,且重现性与 3.5 mL 标准 比色皿相同(图 4)。


讨论 如果已知吸收系数,可通过紫外-可见光谱图上的最大吸收强 度进行定量测量。如此处测量的 BSA 样品,其吸收系数已 知。如果吸收系数未知,则必须通过测量多个标准品建立校准 曲线,并根据校准曲线的斜率计算吸收系数。这是一个耗时的 过程,并可能引起在实验结束前都无法确定的测量误差。 分析人员可以选择在分析序列中加入已知浓度的样品来提高数 据的可靠性。这些加入的样品充当内部对照。这种测量方法的 问题在于不能同时测量样品和标准品,因而在样品和标准品测 量之间各种变量可能发生改变。如本文所述(图 2),同步进 行样品和标样测试可大大减小其他环境变量或可能影响样品前 处理的偏差。在测量可能不稳定的样品时,一次测量一个样品的方法可能会 导致结果错误。将样品置于实验台等待测量的过程中,它们的 吸光度可能会发生改变。引起这一改变的原因可能为温度变 化、照射到溶液的光线的影响或溶液中的化学变化。这可能导 致定量测量时出现系统误差。通过同步测量所有比色皿位置, Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计可消除这些不利变量,并 提高所生成结果的可靠性。同时,还可显著节省测量时间。


结论 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计为蛋白质的定性和定量分 析带来了新的可能。该系统采用独特的非移动式整体多池支 架,专为提高分析效率和重现性而设计。通过同步测量八个比 色皿位置,可有效减少任何可能在后续测量过程中出现的不利 变量。这些特点共同造就了一个强大的分析型紫外-可见分光 光度计系统。 


参考文献 1. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman, D.G., Ed. (1992). CRC Press, Boston









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