三重四极杆液质联用 系统对动物源食品中氯霉素类药物 残留进行分析

摘要：本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用系统建立了 氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和琥珀氯霉素的分析方法。动物源性样品（肌肉、 内脏、蜂产品、水产品、乳制品等）经过提取后，采用薄壳型填料反相 C18 色谱 柱 — Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱分离，经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾 离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在负离子模式下监测。该方法氯霉素在 0.1-10 ng/mL 和其他化合物在 1-100 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2 ≥ 0.998；在 0.1 µg/kg（氯霉素）和 1 µg/kg（其他化合物）添加浓度下，各化合 物峰面积 RSD 在 1.6%-5.7% 之间；定量下限氯霉素达到 0.05 µg/kg，其他化合物达 到 0.5 µg/kg。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察， 得到所建立的方法能在 10 min 内对 4 种氯霉素类药物完成快速、高灵敏度的检 测分析，同时采用同位素内标法进行定量测定，*法规监测要求。

前言：氯霉素 (Chloramphenicol, CAP) 是一种人工合成的广谱抗生素，能引起人的再生障 碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿灰色综合症等疾病，尤其是氯霉素的低 浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。氯霉素的残留不但对人体造成危害，而 且严重影响我国动物性食品的出口。2003 年欧盟规定牛奶、肉、蛋、水产品、 蜂蜜等食品中氯霉素残留检测的极限值 (MRPL) 为 0.3 µg/kg。氯霉素类药物的检测方法目前有 GC/MS 法、LC/MS 法和 酶联免疫法等。近年来，随着液质联用系统和相关技术的 快速普及以及对此类禁用药物越来越苛刻的检测限要求， 液质联用仪技术因其灵敏度高、无需衍生化等特点，已成为动 物源性食品中氯霉素类药物残留量的主要检测确证技术手 段[12-13]，被广泛应用于监督监管。目前国内检测氯霉素类 药物的主要参照标准包括：《GB/T 20756-2006 可食动物肌 肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量 的测定 液相色谱-串联质谱法》、《农业部 781 号公告-2-2006 动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱-串联质 谱法》和《SN/T 1864-2007 进出口动物源食品中氯霉素残 留量的检测方法 液相色谱-串联质谱法》等[1-11]。由于氯霉 素类药物属于禁用类药物，其检出为“零允许量"(Zero tolerance)，考虑到 液质联用仪检测灵敏度能力，氯霉素检测限为 0.05 µg/kg。 针对此类禁用性药物的严格及苛刻的监测需求，本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用 系统建立了快速检测 4 种氯霉素类药物的确证定量方法。 该方法可以满足动物肌肉、内脏、水产品、蜂产品、乳制 品、饲料等动物源性食品中氯霉素类药物残留量的监测。

实验部分 试剂、化学品与消耗品 所有试剂和化学品均为色谱纯级或者分析纯级。甲醇、乙 腈、正己烷和乙酸乙酯购自德国默克 (MERCK)。所用实验 用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水。 氯霉素类药物标准品及同位素内标 (D5-Cap) 购自德国奥格 斯堡 (Dr. Ehrenstorfer)。所有标准品用甲醇配制为 1 mg/mL 储备液，储存在 -20 °C 冰箱内（有效期 1 年左右）。用乙 腈:水 (50:50) 配制混合工作液，储存在 4 °C 下（有效期 1 个 月左右）。 实验采用 Agilent Bond Elut C18 固相萃取柱对样品提取液进 行净化。

仪器配置 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其由 下列部件组成： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 标准自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 自动进样器冷却器 (G1330B） • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统，在正离子模式下进行检测。 采用 Agilent MassHunter 工作站软件（B.07 或以上版本）进 行数据采集、定性和定量分析。 样品前处理 称取 2 g 均质后的样品（精确至 0.1 g）于 50 mL 聚四氟乙烯 离心管中，用 15 mL 乙酸乙酯分两次提取，振荡 30 min， 4000 转/min 离心 2 min，合并提取液，于 40 °C 水浴旋转蒸 发近干。残余物用 20 mL 4% 氯化钠溶液转移至离心管中， 分两次每次加入 10 mL 正己烷进行液-液分配去脂肪。水相 用 15 mL 乙酸乙酯分两次提取，合并提取液，于 40 °C 水浴 旋转蒸发至干。Bond Elut C18 固相萃取柱依次用 3 ml 甲醇 和 3 mL 水活化，用 5 mL 10% 甲醇水溶液溶解残渣全部转 移至固相萃取柱，用 5 mL 甲醇洗脱，收集滤液，氮气下吹 干，残留物用 1 mL 流动相溶解，过滤膜或高速离心后上机 测定。

结果与讨论 本文采用含有薄壳型填料颗粒的 Poroshell 120 EC-C18 色谱 柱对氯霉素类药物进行了有效的色谱分离，此填料 (2.7 µm) 和规格 (3.0 x 100 mm) 的色谱柱具有较高的分离柱效和柱载 量，同时具有较低的色谱压力，非常适合分析动物源样品 基质中的药物残留。采用 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱分析 氯霉素类药物混合工作液所得 MRM 色谱图如图 1 所示。

在鸡肉基质提取液中添加混合工作液，从而获得氯霉素 0.1 µg/kg 和其他化合物 1µg/kg 的基质加标样品，连续进样 10 针测试稳定性。如图 3 所示，4 种化合物在基质低浓度添 加下峰面积 RSD 在 1.6%-5.7% 之间，*测试的稳定性 要求。

由于采用负离子模式分析氯霉素类药物，所以流动相系统 中应避免酸对灵敏度的影响。本方法适用于肌肉组织、内 脏、蜂产品、水产品、乳制品、饲料等样品中氯霉素类药 物的测试分析。注意对于不同基质类型样本的处理方法有 所区别，可参考标准方法进行样本的前处理。

结论 本文所述方法采用 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四 极杆液质联用系统成功实现了对动物源性食品中氯霉素类 禁用药物残留量的高灵敏、快速地确证定量分析。本方法 以国内发布的检测标准为依据，方法学各项参数* 或高于国家标准的检测要求，并可应用于各类动物源性样 品基质中氯霉素类药物残留的快速检测。