前言：单克隆抗体 (mAb) 因其对人类健康的治疗价值而得到了大量关注1 。生物仿制药 是特定疾病创新药物 mAb 的复制品，这类仿制药物 迅速扩大了市场2 。一些用于研究蛋白质构象稳定性3 以及证明创新药物和生物仿 制药之间相似性的方法包括紫外光谱、圆二色性光谱和荧光光谱4 。本应用简报 采用 Agilent Cary 60 紫外-可见分光光度计对一种创新药物（利妥昔单抗）及其生 物仿制药进行了分析。随后利用专用的 WinUV 软件对数据进行了解析，并采用 二阶导数吸收光谱进行了详细的比较。结果不仅突出了 Cary 60 作为此应用分析 解决方案的固有功能，还证明了收集的数据如何提供蛋白质球状结构中芳香族 氨基酸的微环境信息，从而证明了 mAb 在不同测试条件下的稳定性。
紫外-可见光谱的优势 紫外-可见光谱是一种成熟可靠的技 术，能够深入了解蛋白质的总体结 构。它应用广泛，不需要昂贵的试剂 或消耗品。重要的是，紫外-可见光谱 法也是非破坏性的，因此测量的样品 可以回收。在采用液相色谱或质谱等 技术进一步分析之前，这一关键属性 使紫外-可见光谱法成为一种理想的正 交工具。 Cary 60 紫外-可见分光光度计是一种稳 定且高效的分析工具。基于闪烁式氙 灯的光学设计具有*功能，可避免 样品发生光降解；而且省去了仪器预 热时间，有助于提高分析效率。这些 特性确保 Cary 60 紫外-可见分光光度 计常规应用于各种领域，并能获得准 确、精密、可重复的数据。
材料与方法 L-苯丙氨酸、L-色氨酸和 L-酪氨酸来自 安捷伦科技公司。利妥昔单抗创新药 物和生物仿制药购自当地一家药店。 其他所有化学品购自 Sigma-Aldrich。 样品前处理 使用 Tris HCl 缓冲液 (pH 6.0) 配制抗体， 浓度为 500 mg/mL。盐酸胍 (GdnHCl) 用于诱导 mAb 变性，其浓度范围为 0-6 M。将适量蛋白储备液 (10 mg/mL) 和含 0-6 M GdnHCl 的 Tris HCl 缓冲液 (pH 6.0) 混合制得样品。L-苯丙氨酸、 L-色氨酸和 L-酪氨酸用水配制。 吸光度测量和数据分析 Cary 60 紫外-可见分光光度计可获得高 分辨吸收光谱。所有样品在室温下进 行分析，石英比色皿规格为 3 mL，光 程为 1 cm。在 240-350 nm 的波长范围 内，每隔 0.5 nm 采集光谱。 在 Cary WinUV 软件应用中，采用五点 数据过滤的 Savitzky Golay 算法计算得 到二阶导数光谱。在每个原始数据点 之间采用 99 个插入点，所得的导数光 谱中应用一种样条函数，将分辨率提 高至 0.01 nm，以监测 GdnHCl 诱导的 抗体伸展。
结果与讨论 二阶导数吸收光谱有助于分析色氨 酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基（分别为 W、Y 和 F）的微环境，这三种残基 是反映蛋白质结构的一项指标5,6。当 蛋白质从有序变为无序状态时，二阶 导数光谱解决芳香族氨基酸谱带的能 力可以监测吸光度的特定偏移。图 1 显示了除单克隆抗体之外的游离 L-芳 香族氨基酸的扫描光谱和相应的二阶 导数光谱。查看每个二阶导数吸收光 谱时，这些氨基酸和蛋白质的特点可 以清晰地显现出来。二阶导数光谱中 291 nm 处的负峰被选作指标，用于监 测生物仿制药和创新药物 mAb 中色氨 酸残基微环境的改变。 使用 Cary 60 收集二阶导数吸收光谱 后，在化学变性剂 GdnHCl 存在的条 件下，通过比较每种药物对变性作用 的敏感程度来比较利妥昔单抗生物仿 制药和创新药物的结构稳定性。图 2 显示了 0 和 5 M GdnHCl 时创新药物和 生物仿制药的二阶导数吸收光谱。当 mAb 样品溶于 GdnHCl 时，检测光谱显 示，291 nm 附近的负吸收峰发生了位 移（如图 2 中箭头所示）。这表明 mAb 中色氨酸残基的微环境发生了改变。
通过增加 GdnHCl 的浓度对创新药物和 生物仿制药的变性作用进行了比较。 图 3 显示了溶解 mAb 的 GdnHCl 浓度 增加时发生的波长位移。创新药物和 生物仿制药在相近的 GdnHCl 浓度下 都发生了变性，这表明蛋白质结构中 色氨酸残基的微环境是相似的。采用 Cary 60 紫外-可见分光光度计得到的 这一结果证实了早期采用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC)、尺寸排阻色谱法 (SEC) 和肽谱分析得到的研究结果， 即采用安捷伦 HPLC 解决方案时这对 mAb 的初级和高级结构均相似7 。 通过采用导数光谱法生成 a/b 来分析 蛋白质序列中酪氨酸残基的微环境， 这样比较蛋白质的结构也是可行的8,9， 其中，a 代表酪氨酸产生的负峰吸光 度的最大值 (~λ288) 和最小值 (~λ283) 之 间的距离，b 代表色氨酸吸收产生的 第二大值 (~λ294) 和最小值 (~λ291) 之间 的距离（图 4 插图）。图 4 显示了在 GdnHCl 浓度增加的条件下，a/b 随蛋 白质结构的改变而改变。低浓度时， a/b 约为 1.05，这与蛋白质球状结构 一致9 。高浓度时，a/b 增加，这表明 暴露的酪氨酸残基越来越多。创新药 物和生物仿制药具有相似的光谱轮 廓，这表明两种 mAb 中酪氨酸的微环 境相似。
紫外-可见分光光度法能够获得精密、 详细和准确的信息，凸显了这项技术 的潜力。另外，作为一种可以减轻其 他重要分析仪器工作负荷的替代分析 技术，紫外-可见分光光度计这种经济 实惠、简单易用的仪器在实验室中的 应用潜力不可低估。 结论 • 对于创新药物和生物仿制药 mAb 对蛋白质结构的比较，Agilent Cary 60 紫外-可见分光光度计提 供了必要的分辨率和准确度 • 所研究的 mAb 创新药物和生物 仿制药对化学变性剂 (GdnHCl) 表现出相似的伸展类型。这一 结果表明，这对 mAb 的蛋白质 总体结构相似 • 这项研究还表明，二阶导数吸 收光谱可用于比较创新药物和 生物仿制药 mAb 的结构研究
