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蛋白(肽段)定量的意义及出现 MRM 质谱技术平台的缘由

发布时间:2021-12-21   点击次数:929次

蛋白质作为所有生命周期的直接参与者,是生命现象和生物规律 变化的标志物,在生命科学的大环节中占据着举足轻重的地位。 从蛋白质的角度去描述生物的变化,业已成为研究生命科学的主 要手段。处于不同时期、不同条件下的功能性蛋白质,其表现 形式及丰度水平千变万化、生理功能模块和介导信号通路纷繁复 杂,因此,深入研究蛋白质乃至对生物标志物监测充满着艰辛与 挑战。与早期关注蛋白质的发现过程不一样,目前生物化学家越 来越重视功能性蛋白质在表达量上的变化,蛋白丰度的变化更能 体现出生命变化的多样性。生化实验室最根本的分析任务之一就是蛋白的定量分析,但以往 的抗体免疫化学法 (Western Blot) 表现出较差的特异性和较高的 测量误差 (CV > 20 - 40%)。串联质谱多反应监测 (MRM/SRM) 定量方法,一直以来就是定量的黄金标准,在小分子定量上早已 成熟使用,随着液相色谱和串联质谱技术的提高,越来越多的生化实验室开始大量采用串联质谱技术为基础的蛋白(肽段)定量 流程。MRM 肽段定量方法的优点很多,它利用蛋白专属的肽段 序列完成定量分析,一次运行可同时分析几十到几百种的蛋白, 具备高通量的定量分析能力。特别是 2012 年,领域的期刊《Nature Methods》将基于三重四极杆质谱 平台的 MRM/SRM 定量思路的靶向蛋白质组学 (Targeted proteomics) 技术列为当年的年度方法,确立了目标蛋白定量分析的策略。近年来该杂志陆续发表了多篇论文,对 三重四级杆-MRM/SRM 思 路成功应用于目标蛋白定量分析进行了持续报道。随着质谱灵敏 度的大幅提高,以大流速常规液相色谱 (LC) 取代纳流液相色谱 (Nano-LC) 所组成的 MRM 肽段定量方法,代表着蛋白定量分析 的最高技术标准,促进生物化学及各种新应用快速向前发 展,广泛应用在蛋白质组学、生物制药等研究领域,并迅速朝着 诸如食品、环境、临床等更宽的应用范围发展。


MRM 方法作为一种成熟的定量技术,已经广泛用于食品安全检 测和制药行业以及肽段的检测。以制药为例,MRM 方法被用来 监测血样中药物浓度或药物代谢产物随时间的变化。基于质谱 技术的蛋白质组学常用的一种分析策略是采用特异性蛋白酶将蛋 白质酶切形成肽段,生成的肽段经过液相色谱分离后进入质谱分 析,通过鉴定蛋白对应的唯yi性肽段 (Unique Peptides) 来鉴定 相应的蛋白,该方法被称为niao枪法 (Shotgun),是蛋白质组学经 典的非靶向方法。该方法被广泛用于复杂生物样本,如血浆、细 胞、组织中蛋白的大规模鉴定,采用标记或非标记的方式通过相 对定量比较对照组和样品组的差异可以发现具有诊断、预警或治 疗有意义的潜在蛋白质,即生物标记物。仅以癌症为例,目前文 献报道的潜在生物标记物就超过 1261 个[1]。然而,这其中几乎 没有一个潜在生物标记物能满足临床生物标记物的高标准而被认 可,这一点从美国 FDA 批准蛋白类生物标记物的进度就能证实。 过去 15 年,美国 FDA 批准的针对所有疾病的生物标记物平均下 来每年不超过 1.5 个蛋白[2]。在临床上,目前使用的生物标记物 的体内浓度低、动态范围宽,浓度分布能跨越 11 个数量级;在分 析方法上又缺少一种能对大量不同样品进行精准定量的高通量分 析方法。而 MRM 方法能弥补niao枪法的不足,提供了一种高灵敏 度、高精确度、高重现性和高通量的分析方法,非常适用于生物 标记物的验证及系统生物学研究[3]。


MRM 方法充分发挥了 三重四级杆定量的优势。在 MRM 方法中,通 过采用 Q1 和 Q3 分别选择目标肽段的母离子和子离子来实现对 应目标蛋白的精确定量。两级四极杆筛选为 MRM 方法提供了极 高的选择性,降低了复杂样品中共流出物的背景干扰[4]。同时, 三重四级杆方法采用选择离子通过模式,相比于niao枪法的传统全扫描模 式,方法的灵敏度提高了 1 - 2 个数量级。另外,MRM 具有五 个数量级的线性动态范围,能够检测复杂样品中的低丰度蛋白, 这在系统生物学定量研究中至关重要。MRM 检测肽段方法建 立后,在不同的实验室里重复实验具有非常好的重现性;一个方 法内可包含上千个 MRM 离子对,能实现高通量的检测[5]。通过 加入稳定同位素标记内标肽段 (Stable Isotope-labeled internal standards, SIS),可以大大降低离子抑制、基质效应和样品前处 理过程的误差造成的影响,得到更准确的定量结果。对于一组给 定的待测蛋白质,如信号通路上蛋白质、一组生物标记物,MRM 方法能够进行一致的、可重复的、高通量的精准定量分析[6]。相 比于亲和方法,MRM 不受到抗体种类及特异性的限制,能够很 方便的进行大规模研究。 目前靶向肽段定量的蛋白测定法,可以开展大规模的蛋白质组学 定量分析项目,以及在大规模地开发、系统性地验证蛋白质生物 标志物;加之快速成熟的分析方法和软件,以及广泛接受和普遍 使用的质谱仪器,为生物化学家提供了系统、可靠、革命性的蛋 白定量平台,促进了系统生物学、临床研究、生物制药及 其它相关应用领域的高速发展。

 

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 MRM 肽段定量的完整流程包含如下 6 个模块:① 获取靶 蛋白序列,② 选择特异序列肽段(Skyline 软件),③ 构建 MRM 离子对及参数优化(Skyline 软件或安捷伦 optimizer 软件),④ 样品处理及制备,⑤三重四级杆数据采集及 ⑥ 分析结果(安捷伦 MassHunter 定量软件或 Skyline 软件)。 简单介绍一下这六大模块。首先,① 从实验或科学文献着手获得 已知蛋白的序列表,实验的关键点就是要选择出靶蛋白的典型肽 段。MRM 最希望检测的是稳定的肽段,所以为了减少可能的误 差,要尽量避免用容易发生人为修饰的残基肽段,比如:蛋氨酸 (易发生氧化反应)和半胱氨酸(易发生脲甲基化和氧化反应) 等。② 选出来的肽段序列应该是唯yi对应其蛋白质,越能提高 检测的特异性,就越能减少对结果干扰,由于生物样本的复杂 性,每一个肽段往往需要选择三个离子对(母离子-子离子)所产生的信号。利用 Skyline 软件可以便捷地从特异性的肽段构建 MRM 离子对做定量分析。③ 配适 Agilent 1290 Infinity II 液 相色谱/6495 三重四极杆液质联用系统 (1290 LC/6495 三重四级杆) 的 Skyline 专业软件可以智能优化肽段的保留时间、碰撞能量,并采 集出优化后的实验结果供科学家审核,最终自动生成分析实际样 品的实验方法。④ 蛋白定量的实验要求苛刻,且基质复杂肽段 碎片众繁,因此蛋白样品制备就成为能否成功的关键一步,安捷 伦 AssayMAP 可以实现对样品精准、高通量而且可靠耐用的自动 处理。⑤ 样品通过液相的分离和串联质谱的 MRM 测量,⑥ 最 终结果可利用 MassHunter 定量软件或 Skyline 软件分析并计算 蛋白丰度。从六大模块流程中可以看出,安捷伦肽段定量流程的 设计理念和软件支持有*之处,其流程特点及技术优势在下文 详述。


基于 三重四级杆 平台的 MRM 肽段定量方法灵敏、精确,同时具有高 重现性和高通量。随着蛋白质组学不断发展,在实验室的纯理论 研究已经不断向各个应用领域渗透,越来越广泛地应用于以蛋白 质研究为基础的多种新兴应用分析领域,诸如:生物药物的临床 使用、抗体药物偶联物 (ADC) 的研究、蛋白药物的毒性预测等; 甚至是原来的传统小分子分析领域,像食品安全分析(蛋白质鉴 别,过敏原分析等)、临床疾病诊断(发现并鉴定大量功能蛋白 质和潜在疾病蛋白质标志物)、环境保护(生物毒素监测,暴露 组学等)、能源化工(生物燃料质量控制),也都出现了对生物大分子丰度测定的需要。安捷伦在 AssayMAP 样品自动化前处理 和 三重四级杆平台基础之上,巧妙借助生物肽段序列的质谱信息数据库 和数据分析设计软件,开发出了系统性的 MRM 肽段定量方法, 从而可以高灵敏、高精密度和高效地定量分析蛋白质以及其衍生 出的肽段生物分子,获得这些蛋白质的表达丰度,为蛋白质差异 分析提供了更可靠、动态范围更广的技术手段,方便生命科学家 深入了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学,为人类健康 的福祉服务。

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