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利用液质联用仪定量分析血浆中的儿茶酚胺类物质

发布时间:2022-01-04   点击次数:195次

摘要 本研究中开发出了一种用于血浆中去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺定量的灵敏度高、 特异性好的 LC/MS/MS 分析方法。采用 Agilent Captiva NDLipids 过滤产品和选择性固 相萃取流程对血浆进行净化。此分析方法可达到所需的实用灵敏度,同时还能对相当宽 动态范围内的分析物进行定量分析。所有化合物均表现出出色的重现性 (CV < 5%),且 所有校准曲线都获得了线性 (R2 > 0.9997)。


前言 本研究开发出的高效样品前处理流程适用于 同时提取血浆中的去甲肾上腺素、肾上腺素 和多巴胺(图 1)。将不同浓度的各种分析物 加入洁净血浆中可制得校准物。液相色谱/ 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于 像上述多种分析物的快速分析。色谱系统采 用 Agilent Pursuit 五氟苯基 (PFP) 色谱柱以 及甲醇与 1 mM 氟化铵水溶液组成的流动相。 研究中对定量 MRM 离子对进行监测,并加 入了每种分析物的氘代内标以确保定量分析 的准确性与重现性。


实验部分:液相色谱方法 液相色谱系统由 Agilent 1290 Infinity 液相色谱二元泵、配备恒温箱的孔板进样器以及 柱温箱组成。如果使用的液相色谱系统具有 不同的延迟体积,则可能需要调节并验证梯 度以重现出相同的色谱分析结果。 质谱方法 安捷伦 MS/MS 系统由采用安捷伦喷射流 技术的 Agilent 6460 三重四极杆质谱仪和 Agilent MassHunter 软件 B.07.00 组成。

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化学品与试剂 校准物购自 Cerilliant (Round Rock, TX)、剑 桥同位素实验室 (Tewksbury, MA) 以及 Medical Isotopes 公司 (Pelham, NH)。DC Mass Spect Gold 血浆 MSG3000 购自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 血浆内分泌激素对照品 0010 和 0020 购自 ChromSystems。Burdick & Jackson LC/MS 级甲醇和试剂购自 VWR 和 Sigma-Aldrich。 将 5.75 g NH4H2PO4 溶解于 500 mL 水中, 并用 30% 的 NH4OH 将其 pH 调节为 10,以 制得 pH 为 10 的 100 mM NH4H2PO4 缓冲液。 样品前处理 校准物 (Cerilliant) 由洁净的血浆基质 (Golden West Biologicals) 制得。采用同位素标记的 内标 (Cerilliant) 并对其浓度进行调节,使其 响应处于所需校准曲线范围的中部。实验采 用 ChromSystems 血浆对照品。重要信息: 在样品分析之前,血浆应冷冻保存于 –80 °C 下。采用含 0.5 M EDTA 和 317 mg/mL 焦亚硫酸钠的稳定剂

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数据分析 Agilent MassHunter 定量数据分析软件 (B0.07.00) 用于进行数据分析。在校准曲线 的线性回归中采用 1/x 作为加权因子。在 MassHunter 定量软件中,利用色谱峰面积 与已知浓度内标的峰面积之比进行定量。


结果与讨论 通过 PFP 色谱柱实现了所有分析物的色谱分 离(图 2)。在每次运行结束时进行额外的 清洗以获得重现性。尽管未采用此方 法并进行测定,但肾上腺素与去甲变肾上腺 素之间的分离以及以及变肾上腺素与 3-甲氧 酪胺之间的分离尤为关键,因为这些化合物 产生相同碎片。如果不根据保留时间进行适 当分离,这些化合物将相互干扰,导致不准 确的定量结果。图 3 显示了这些化合物的分 离结果。 为研究 SPE 萃取流程的基质效应和回收率, 实验中配制并分析了 A、B、C 三组溶液。 这些混合物中包含 9 个不同浓度的全部三种 分析物及其内标。将溶液 A 加标至 0.2% 甲 酸水溶液中,并进样分析。对溶液 B 中的洁 净血浆进行萃取后对其进行加标(萃取后)。 对溶液 C 中的洁净血浆进行加标后对其进行 萃取(萃取前)。

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基质效应和回收率的计算公式如下: 基质效应% = B/A × 100 回收率% = C/B × 100 A = 净标准溶液 B = 萃取后加标的血浆(萃取后) C = 加标后萃取的血浆(萃取前) 三种被分析物的基质效应介于 42% - 119% 之间,而回收率介于 56% - 59% 之间(表 2)。 因此,虽然在结果观察到了基质效应,但通 过内标补偿后仍获得了可接受的回收率,如 表 3 和表 4 所示。 连续三天对校准标样进行萃取,以确定日间 精密度和准确度。全部三种分析物均得到了 可接受的准确度,且线性范围内所有浓度的 变异系数均小于 5%(表 3)。分别于连续 三天以及一天中三次对 ChromSystems 对 照品进行萃取以确定日间和日内的变异系数, 所得到的变异系数均小于 4%(表 4)。该方 法在浓度为 5 - 2500 pg/mL 的测定范围内具 有出色的线性,R2 值均大于 0.9997(图 4)。

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结论 本研究中开发出了一种用于血浆中肾上腺素、 去甲肾上腺素和多巴胺的稳定定量分析方法。 利用 Agilent Captiva NDLipids 过滤和固相 萃取产品同时提取出全部三种分析物,并 获得了良好的回收率。研究中还开发出与 LC/MS/MS 条件兼容的分析物的色谱分离 方法。



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