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大家都了解液质联用技术对胶类药材进行鉴定

发布时间:2022-01-20   点击次数:161次

摘要:本文基于 2015 年版《中国药典》[1] 中采用液质联用技术分析胶类药材的定性方法,开 发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用 法和四极杆飞行时间液质联用 (LC/Q-TOF) 法进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别;同时,利用 Q-TOF 强大的化合物 定性能力,结合蛋白质库,建立了特征肽段序列分析方法以及“假药”的初步定性方法。


前言:胶类药材是我国传统中药中一类特殊的动物药,是由动物的皮、骨骼等经特殊工艺加工 而成,常见的有阿胶、鹿角胶、龟甲胶及其相关中成药制剂。近年来,随着胶类药用量 增长,原料资源供不应求,新闻曝光了一些不法生产企业为降低成本,采用其它动物杂 皮投料,给消费者的健康带来严重隐患。为了保障公众用药安全有效,2015 年版《中国 药典》[1] 制订了符合胶类药材特点的定性方法:采用液质联用技术,分析阿胶、鹿角胶、 龟甲胶的特征肽段,方法专属性强、科学可靠。 安捷伦科技公司针对这一变化开发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用法,进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别。同时,鉴于很多实验室有高分辨质谱测试 需求,我们在药典 液质联用方法的基础上,开发了四极杆飞行时间液质联用 (LC/Q-TOF) 法。此外,利用 Q-TOF 强大的化合物定性能力,结合蛋白质库,建立了特征肽段序列分 析方法以及“假药”的初步定性方法。


实验部分:试剂和样品材料 实验用色谱纯乙腈购自 Merck,色谱纯甲酸购自 Dikma,超纯 水为 Milli-Q 系统制备,碳酸氢铵购自 ACROS,胰蛋白酶购自 Promega。样品材料为市售阿胶、鹿角胶、龟甲胶。 仪器 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱 Agilent 6460C 三重四极杆质谱仪 Agilent 6530 四极杆飞行时间质谱仪


样品制备 取样品粉末 0.01 g,加 1% 碳酸氢铵溶液 5 mL,超声处理 30 分 钟后,用 0.22 uM 微孔滤膜过滤,取续滤液 100 μL 置微量进样瓶 中,加胰蛋白酶溶液 10 μL(采用序列分析用胰蛋白酶,加 1% 碳 酸氢铵溶液制成每 1 mL 中含 1 mg 胰蛋白酶的溶液,临用时配制), 摇匀,37 °C 恒温酶解 12 小时。


色谱条件 色谱柱: Eclipse Plus C18(2.1 x 100 mm,1.8 μm) 柱温: 40 °C 进样体积: 5 µL 流速: 0.3 mL/min 流动相: A:H2O 含 0.1% 甲酸;B:乙腈 梯度洗脱: 0 min 5%B;25 min 20%B;40 min 50%B 三重四极杆串联质谱条件 质谱系统: Agilent 6460C 离子源: 配备安捷伦喷射流的 ESI 模式: 正离子 雾化气: N2 雾化气压力: 30.0 psi 干燥气温度: 325 °C 干燥气流量: 8.0 L/min 毛细管电压: 3500 V 鞘气温度: 350 °C 鞘气流量: 12.0 L/min 喷嘴电压: 0 V Delta EMV: 0 V 扫描模式: MRM 表 1 中列出了与待测物相关的 MS MRM 参数

 

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四极杆飞行时间质谱条件 质谱系统: Agilent 6530 离子源: 配备安捷伦喷射流的 ESI 模式: 正离子 雾化气: N2 雾化气压力: 30.0 psi 干燥气温度: 325 °C 干燥气流量: 8.0 L/min 毛细管电压: 3500 V 鞘气温度: 350 °C 鞘气流量: 12.0 L/min 喷嘴电压: 0 V 扫描速度: 3 谱图/秒 扫描模式: 鉴定采用 Target MS/MS, 未知肽段定性采用 Auto MS/MS 表 2 中列出了与待测物相关的目标质量数

 

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结果与讨论 基于 2015 年版《中国药典》开发的 液质联用法分析胶类药材,重现性好、灵敏度高。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各 MRM 通道信噪比均大于 500,其中龟甲胶的 631.3→546.4 通道信噪比大于 77000(如图 1 所示),能够满足 2015 年版 《中国药典》信噪比大于 3:1 的要求。

 

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采用 LC/Q-TOF 法分析胶类药物时,利用 Target MS/MS 模式采集数据,运用高分辨 EIC 碎片离子提取技术进 行数据处理,可以获得与液质联用法一致的定性结果。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各特征离子信噪比均大于 200,同 样满足 2015 年版《中国药典》信噪比大于 3:1 的要求。图 2 为采用 LC/Q-TOF 法分析龟甲胶所得特征碎片 离子色谱图。

 

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此外,Q-TOF 可以提供可靠的 MS 和 MS/MS 数据,其具有强大的化合物定性能力,结合蛋白质库,可以进行特 征肽段的序列分析。图 4 和图 5 展示了阿胶中上述特征肽段 m/z 618.3 二级质谱图及其序列分析结果。该特征 肽段位于驴的 I 型胶原蛋白 α2 链上第 692 – 706 位置上,氨基酸序列为 G-E-A-G-A-A-G-P-A-G-P-A-G-P-R。

 

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结论 分别采用 Agilent 6400 系列液质联用和 6500 系列 Q-TOF 液质联用 系统,针对 2015 版药典收载的阿胶、龟甲胶、鹿角胶三种胶类 药材进行定性方法开发,结果表明,阿胶、龟甲胶、鹿角胶的信 噪比远远优于药典的要求。在此基础上,开发了胶类药品的专属 性肽段鉴别方法以及特征肽段序列分析方法,并将特征肽段分析 成功应用于一例“假龟甲胶”的鉴别中

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