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利用塞曼石墨炉原子吸收光谱测量血清中的硒

发布时间:2022-01-20   点击次数:203次

前言:由于母婴饮食中硒的缺乏,导致一些新生儿血清样品中的硒含量仅处 于 20 µg/L 的痕量水平 [9]。 此前业内已发表了大量有关通过 GFAAS 测定血液和血清中的硒的分 析方法 [1,5,6,7,9]。本研究介绍了新仪器和程序的应用,这对于获得最 高准确度和精密度非常重要。


硒的测定面临着诸多困难:

• 196.0 nm 的共振波长处于远 UV 区,样品中可能存在的有机化合物 和无机化合物在该波长下均会产生分子吸收。这一问题可通过塞 曼背景校正加以解决 利用塞曼石墨炉原子吸收光谱测量血 清中的硒 应用简报 作者 John Sanders 安捷伦科技公司 澳大利亚墨尔本 临床研究 2

• 传统空心阴极灯在该波长下的强度导致精密度 有限 [6]。而增强放电空心阴极灯可提高光源的 强度,从而降低噪音水平。此外,选择特殊的 光电倍增管有助于在该光谱区提供优异的响应

• 在血清这种复杂的样品基质中,硒可能存在于 各种化学物质中的任何一种中,这会导致石墨 炉的原子化器产生原子化问题。采用化学改性 剂能够解决这一问题

• 硒的挥发性非常强,可能在灰化阶段产生损 失。必须使用合适的改性剂与硒形成化合物, 以使分析物在原子化之前能够在较高的灰化温 度下尽可能多地除去基质


实验部分 仪器 本研究使用 Agilent SpectrAA-880 塞曼石墨炉原子吸收光谱仪和可编程进样器。 该仪器配备了 R166UH 光电倍增管,并在 15 mA 阴 极电流和 20 mA 增强电流下操作 Se 增强放电空心 阴极灯。 所需试剂 10% 的消泡剂 B 乳浊液 (Sigma Chemical)。重要的 是,消泡剂应为具有纯白色乳状外观的稳定的不分 散乳液。而来自其他供应商的消泡剂产品批次出现 了分离现象;这种分离的材料不能满足要求。 Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 (BDH) 硒标准品 1000 mg/L Mallinckrodt AA 标准品 Seronorm 标准品 Nycomed Pharma AS Norway 批次号 010017血清对照样品 UTAK 痕量元素对照样品,正常 浓度,批号 7772 L-抗坏血酸 BDH AnalaR 级 氯化钯 1000 mg/L Mallinckrodt AA 标准 品,PdCl2


试剂制备:样品稀释剂 0.056% wt/vol 抗坏血酸 0.088% vol/vol Triton X-100 0.1% vol/vol 消泡剂“B" 配制样品稀释剂:将 0.56 g 抗坏血酸、0.88 mL Triton X-100 和 1 mL 消泡剂 B 溶于少量去离子水中,加入 0.1 mL 盐酸并将溶液稀释至 1.0 L。 加入盐酸以降低溶液的 pH,并确保在稀释剂与血 清样品混合时获得澄清溶液。尽管该溶液可保持 稳定长达 2 天时间,还是建议使用当天配制的新鲜 溶液。 自动进样器清洗 0.05% Triton X-100,0.1% 消泡剂 B 移取 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 mL 消泡剂 B 至 1 L 标 准烧瓶中,用去离子水稀释至 1.0 L。 改性剂 500 mg/L 钯,0.05% Triton X-100,0.1% 消泡剂 B: 移取 10 mL 1000 mg/L 的钯标准品和 2 mL 浓盐酸至 20 mL 标准烧瓶中。加入 100 µL Triton X-100 和 20 µL 消泡剂 B,并用去离子水稀释至 20 mL。 标样 标样原液 1.00 mg/L 3 通过使用蒸馏-去离子水将 10.00 mL 的 1000 mg/L 标 准品稀释至 1 L 来配制 10 mg/L 的标样,然后通过 使用样品稀释剂将 10.00 mL 10 mg/L 的标样稀释至 100 mL 来配制 1.00 mg/L 标样。


工作标样 依据表 1 所列的比例,分别将不同量的由样品稀释 剂配制而成的标样添加至每份 Seronorm 标准品中 配制工作标样。 所有溶液均在标准烧瓶中稀释至最终体积为 10 mL。 在配制溶液过程中,将 Seronorm 标准品添加至 10 mL 干燥的烧瓶中,然后加入 1 mg/L 的标样。静置约 一小时,然后用样品稀释剂稀释至最终体积。

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自动进样器准备 将自动进样器清洗瓶注满 Triton X-100/消泡剂 B 清洗 液,按照操作手册中推荐的方法对系统进行吹扫。 样品毛细管的必须保持严格清洁,并且应在每 次自动运行开始时用王水进行清洗。该清洗过程最 好通过以下方式进行:将酸注满样品瓶并手动将自动进样器探头的浸至酸 中。然后使用进样注射器将酸吸入毛细管中,确保 所有残留物和污染物均被移除。采用注射器将酸推入并吸出毛细管,使酸与毛细管 接触 2–3 min。 最后使用 Rinse(清洗)命令除去酸并清洗毛细管 两到三次。


样品前处理 注意:所有样品都应视为潜在的生物危害物,在样 品处理中必须遵守当地卫生管理局所要求的全部安 全预防措施。 用样品稀释剂按 1:10 的比例稀释样品(在样品体 积有限的情况下,可在微量水平进行):用 90.0 µL 样品稀释剂稀释 10.0 µL 样品,并将其直接放入样 品杯中。 为保持样品与标样添加组中的改性剂浓度与添加剂 相同,不得用蒸馏水稀释样品。 分析 采用 SpectrAA-800 标签文件创建样品列表以进行样 品识别。该列表可直接从其他数据文件(如逗号分 隔的文件)中导入。所示的方法采用添加预混合标 样的方式,目的是获得准确一致的报告结果。由于 样品的复杂性,需要使用预混合的标样。 设置表 2 中所列出的操作条件并启动序列操作。 利用 SpectrAA-800 软件中所包含的 QC 方案,该系 统可通过自动重新校准或发出可疑结果警告来监视 对照样品的性能和仪器性能。

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校准曲线在吸光度 0.3 以上基本呈线性,如图 1 所 示。校准曲线的回归方程为: ABS = 0.00082786*Conc + 0.00000003*Conc [2]。 这说明能够放心地在更广泛的分析范围内采用标样 添加技术及其应用。

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对石墨管进行老化处理十分必要,需要使用样品或 空白对石墨管进行 6 至 9 次空烧,从而在管内形成 涂层。一旦形成,则不得破坏该涂层。避免使用管 线清洗功能去除残留物。经试验发现,该方法能够 分析 40–80 个样品且不受血清灰分残留的干扰。使 用管线清洗功能将导致石墨管的寿命大大缩短且精 密度下降。


使用钯作为改性剂十分方便和有效 [4,5,8]。尽管在 Se 测定中也推荐使用其他改性剂,例如镍,但是 使用镍会导致石墨炉中的镍残留量较高。如果用户 随后希望分析痕量的镍,这将会带来麻烦。 仪器基线噪音水平会限制分析的精密度。研究发 现,有两种可用途径能够减小该噪音源。 首先,使用增强放大空心阴极灯提高灯的光输出。 其次,利用特殊的 UV 敏感型光电倍增管(如 Hamamatsu R166UH)也可获得更高的增益,相比 于普通 R446,该光电倍增管在低 UV 区的辐照灵敏 度提高了将近六倍。R166UH 光电倍增管的另一项 优势在于其在可见光区具有极小的响应,因此在 使用 2500 °C 以上的原子化温度时,不易受到散射 石墨炉辐射所形成的噪音的影响。图 3 和 4 对使 用不同光源和检测器获得的信号进行了比较。使 用 R166UH 和增强放电空心阴极灯获得的改善非常 明显,并体现在分析的精密度中。此外,使用增强 放电空心阴极灯和 R166UH 光电倍增管还可降低检 测限。

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将增强放电空心阴极灯用于硒的测定的另一项优势 在于灵敏度提高,这是由于同传统的空心阴极灯相 比,其在 196.0 nm 共振谱线处的信噪比得以提高。 硒的形态分析是石墨炉原子化的一个已知问题,如 Jacobson 和 Lockitch [9] 以及 Johannessen 等人 [4] 所述。这使对于通过各种技术获得的结果的总体有 效性产生了一些担忧。在此背景下,本分析采用峰面积而非峰高可能更为有利。SpectrAA-800 特别适 用于本项工作,在分析低吸光度水平的样品时,可 获得足够高的数值分辨率,例如小数点后四位数, 并且能够同时记录峰高和峰面积结果。此外,还能 够查看每次空烧的曲线,从而在确定最终结果时可 以将那些表现出假峰或异常峰形的谱峰排除。表 3 数据在不同日期内获得,表明对于 UTAK 对照样品 (批号 7772),通过峰面积和峰高均获得了出色的 分析结果。

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利用石墨炉 PROMT 测量模式还可以提高分析速 度。在该模式下,用户可定义所需的精密度和最多 重复测定次数。一旦获得期望的精密度,系统将自 动转到下一个样品。与此同时,自动进样器在当 前样品原子化的过程中准备下一次进样的溶液。 相比于传统仪器,每个溶液的分析速度可节省约 30 秒,获得具有已知精密度的结果,能够节省大 量时间。 血清的复杂性导致蛋白质和脂肪物质积累在样品 探头中和样品探头周围。采用包含乳化硅油的消泡 剂 B 可以在探头的润湿表面上形成一层薄的硅油涂 层,使其具有疏水性并确保表面清洁。这样可避免 交叉污染并提高重现性。 消泡剂 B 还使改性剂和样品均匀分散于石墨管中, 可在关键的干燥和灰化阶段中减少起泡。


结论 本文所述的程序为分析血清中的硒提供了一种 可靠的分析方法,浓度 100 µg/L 下的变异系数优 于 5%。







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