三重四极杆质谱测定食用贝类中原多甲藻酸贝类毒素

摘要：我们已开发了一种检测贝类中原多甲藻酸贝类毒素的方法。该方法采用改进的 QuEChERS进行样品前处理。使用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统结合 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统完成样品的分离和定量分析。本文研究表明，该方法操作简便，快速可靠，可以在远低于法规规定的限度水平下进行分离和检测。

前言海洋生物毒素是全球食品安全关注的主要焦点之一，尤其是在沿海国家。中国的海洋食品易受海洋生物毒素的污染。近年来，由于水体的工业化和富养化，中国的内海经常发生浮游植物的大量增殖。水生物种的大规模海水养殖，尤其是占中国海水养殖产品总产量 40.7% 的贝类养殖，进一步促进了浮游植物的增殖。原多甲藻是一种浮游植物，其各种亚型在中国海域广泛分布，一些亚型的原多甲藻能够分泌原多甲藻酸 (AZA) 贝类毒素，这是一类海洋生物毒素，是我们重点选择研究的一类目标化合物。这些海洋毒素的毒性很高，它们在水生物种中的生物富集、转化和代谢，以及对来自污染水域食用贝类的消费，都可能对人类健康造成严重威胁。AZA 暂定的参考剂量低至 0.04 µg/kg BW [1]。当前，欧盟规定贝类中总 AZA 的最大残留量是 160 µg/kg [2]。中国正在制定自己的海洋生物毒素监管法规，尤其是对于那些如 AZA 等急需监测的毒素。检测 AZA 的常用方法是小白鼠生物检定法和 LC/MS/MS 技术。然而，与小白鼠生物检定法相比，LC/MS/MS 具有更高的选择性、灵敏度和准确度，并且我们一般认为 LC/MS/MS 方法执行起来相对简单、耗时短，而且还不容易产生假阴性结果。本研究的目的是采用 LC/MS/MS 建立一个简单、快速、灵敏度高的方法，用于日常监测不同贝类如贻贝、牡蛎、蛤蚌和扇贝当中三种最常见的 AZA 毒素（AZA1、AZA2、AZA3），为中国相关标准方法的开发提供支持。

实验部分样品前处理按照如图 1 所述的过程对样品进行前处理 [3]。向样品中加入 5 gMgSO4 和 2 g NaCl，再加入 85% 乙腈水溶液匀质并提取样品。所得提取物采用 C18 吸附剂进行净化，然后旋转蒸发至近干。残渣用 80% 乙腈水溶液复溶并依次通过滤膜过滤。采用乙腈/水梯度洗脱进行分离。然后采用正离子电喷雾离子化 (ESI+) 和多反应监测 (MRM) 检测含有羰基和醚氧配体的 AZA（图 2）。

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结果与讨论三种 AZA 的分离首先优化表 2 列出的每个化合物的 MRM 离子对参数，以实现高检测灵敏度。使用乙腈/水流动相，其中含 0.1% 的甲酸，5 mM醋酸铵作为水相的改性剂，所得色谱图说明这三种化合物实现了基线分离（图 3）。

净化吸附剂的选择考察弗罗里硅土、C18、PSA 和 GCB 作为吸附剂净化提取物的效果。我们发现，极性吸附剂弗罗里硅土很难从基质中吸附脂类成分，导致贝类基质中 AZA 的回收率降低。GCB 对具有平面环状结构的化合物具有很强的吸附性，因此它会强烈吸附 AZA 并导致其回收率很低。PSA 是一种碱性吸附剂，会与 AZA 这类酸性化合物有相互作用，从而也可导致低回收率。相比而言，C18 可以有效去除脂类和碳水化合物，当然，过量使用 C18 也会降低回收率。多次试验后发现，如果预先加入 1 g MgSO4，每 20 g 样品再加入 1 g 净化吸附剂 C18，即可获得高的回收率。利用定性/定量 MRM 离子对比率确证化合物针对加标 AZA 1 µg/kg 的扇贝基质，比较了其定性 MRM 和定量MRM 离子对。如图 5 所示，定性与定量 MRM 离子对的比率范围是 100.4% - 104.4%，表明分析物的鉴定正确。

方法性能针对每种基质中的 AZA，分别建立了基质匹配的校准曲线。加标浓度范围内获得了良好的线性关系，相关系数 ≥ 0.996。每种化合物的 LOQ 测定为 1.0 µg/kg。扇贝基质的典型性能见表 4。分析AZA 加标浓度分别为 10、20 和 50 µg/kg 的混合贝类基质，表明总体回收率在 71–108% 范围内，RSD 为 4.69–7.81%，表明方法准确度高、精密度好（表 5）。重复性、重现性和回收率我们还检查了方法的日内和日间回收率和精密度。如表 6 所示，该方法具有良好的回收率和精密度。

真实样品筛查检验了包括扇贝、贻贝、牡蛎和陆蛤等 17 个样品。其中 7 个样品中检测到 AZA（表 7）。其中，三个样品中的 AZA 浓度高于10 µg/kg，但仍低于当前规定的*浓度 160 µg/kg。

结论本文介绍了一种优化的 QuEChERS 样品前处理和 MRM 模式下与LC/MS/MS 联用，检测各种贝类中三种原多甲藻酸贝类毒素的方法。所建立的方法灵敏度高，每种 AZA 的 LOQ 为 1 µg/kg。在加标浓度范围 1–100 µg/kg 内，基质匹配的校准曲线具有良好的线性，R2 > 0.99。回收率在 71–108% 范围内，精密度低于 10%(RSD)。方法操作简便、快速可靠，因此可*实际样品如蓝贻贝、牡蛎、陆蛤和扇贝中 AZA 的筛选分析。