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紫外-可见分光光度计可方法测定蔗糖中的总亚硫酸盐 (SO2)

发布时间:2022-06-22   点击次数:230次

前言:药物制剂中添加药物赋形剂不是因为其具有治疗活性,而是为了优化生产过程,帮助提高制剂稳定性或生物利用度,并提高患者的可接受性[1]。蔗糖 (C12H22O11) 是制药行业中常用的甜味剂,常用于掩盖口服药物令人不快的味道,充当防腐剂,以及提高液体药物的粘度。为确保药物制剂中使用的蔗糖的安全性和质量,需要对杂质进行准确测定。亚硫酸盐是蔗糖中常见的杂质。美国药典方法 USP43-NF38-6076[2] 介绍了一种使用紫外-可见分光光度法测定蔗糖中总亚硫酸盐含量的酶解方法。在本研究中,我们将展示 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计在根据 USP 方法测定蔗糖中总亚硫酸盐方面的优势。

 

实验部分背景USP43-NF38-6076 方法的原理是,在有氧条件下,亚硫酸盐被亚硫酸盐氧化酶氧化,生成硫酸盐和过氧化氢,如下面的反应方程式所示。(亚硫酸盐氧化酶)SO32– + O2 + H2O SO42– + H2O2 (1)然后,在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的存在下,生成的过氧化氢被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸过氧化物酶(NADH 过氧化物酶)还原,如下面的方程式 2 所示。(NADH 过氧化物酶)H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+ (2)反应中生成的 NAD+ 的量与样品中亚硫酸盐的含量成正比。通过测量 340 nm 处的吸光度可以确定 NADH 的消耗量。通过计算空白和样品反应前后的吸光度差值 (A1–A2) 可以确定总亚硫酸盐浓度。A1 为酶解反应开始时的吸光度。A2 为酶解反应结束时的吸光度。为了获得 ∆A亚硫酸盐,用样品的吸光度差(A1–A2) 减去空白的吸光度差 (A1–A2)。根据下面的公式,可以计算亚硫酸盐浓度(以 SO2 计)[g/L]:C(总 so2) = V × Mol.Wt × ∆A亚硫酸盐 (3) ε × d × v其中:V = 最终体积 [mL]Mol.Wt = SO2 的分子量 [g/mol]ε = NADH 在 340 nm 处的消光系数 = 6300[l × mol–1 × cm–1]d = 光程 [cm]v = 样品体积 [mL]

 

实验部分样品前处理样品 1 和样品 2 溶液:将 2.0 g 蔗糖(Sigma Aldrich,CAS 号57-50-1)溶于 5.0 mL 蒸馏水中,得到最终浓度为 400 mg/mL的样品 1。使用 2.0 g 市售蔗糖(购自当地超市),重复上述流程制备得到样品 2。亚硫酸盐标准溶液 (80 ppm SO2):将 157.5 mg 无水亚硫酸钠溶于 1.0 L 蒸馏水中,得到最终浓度 0.1575 mg/mL。参比溶液:将 4.0 g 蔗糖(Sigma Aldrich,CAS 号 57-50-1)溶于 5.0 mL 蒸馏水中。加入 0.5 mL 上述亚硫酸盐标准溶液,然后用蒸馏水将所得溶液稀释至 10.0 mL。标准溶液:将 1.0 g 柠檬酸加入 1.0 L 容量瓶中,并用 1.0 L 蒸馏水溶解。然后,准确称取 800 mg 无水亚硫酸钠(Merck,CAS 号 7757-83-7)并加入溶液中(最终浓度约 400 mg/L,以 SO2 计)。用适量的 1 g/L 柠檬酸溶液稀释储备液,配制多个浓度的亚硫酸盐标准溶液(0–400 mg/L,表 1)。


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7 个标样各自的浓度如表 1 所示。使用可选的 A g i l e n tOpenLab 软件和仪器随附的 Cary 紫外工作站软件进行检测。OpenLab 提供了有助于满足 21 CFR Part 11 和附录 11 数据可靠性要求的工具。这些工具包括针对每次更改的可供检索的审计追踪。

 

结果与讨论根据 USP 方法定量分析蔗糖样品中的总亚硫酸盐为了根据 USP43-NF38 专论方法测定蔗糖中的总亚硫酸盐含量 (SO2),应在反应开始 (A1) 和结束 (A2) 时记录约 340 nm 处出现的最大吸光度。然后从这些值中扣除空白溶液获得的相应值。样品溶液的吸光度差 (A1–A2) 不应超过参比溶液吸光度差的一半。使用 Agilent Cary 3500 紫外-可见分光光度计测得的蔗糖样品 1和样品 2 的 ∆A亚硫酸盐分别为 0.0023 Abs 和 0.0044 Abs(表 5)。两个样品的 ∆A亚硫酸盐均小于参比的一半,并且在 USP 规定的可接受范围内。结果表明,Cary 3500 适用于蔗糖中亚硫酸盐杂质的测定。

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标准溶液中总亚硫酸盐的定量分析Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计可同步测量 8 个样品池位置(7 个样品和 1 个参比)。通过在反应开始前、反应过程中和反应结束后,在 300–400 nm 波长范围内进行 12 次扫描,在相同条件下同时监测 7 个标样(图 2)。同时测量多个样品/标样的功能消除了环境和操作人员造成的分析误差以及由此带来的数据准确性风险。Cary 紫外工作站动力学应用程序使分析人员可以选择不连续的波长或特定波长范围进行扫描。使用 Cary 紫外工作站动力学应用程序同时测量 7 个标样各自的吸光度 (A1)。其方式为测量 300–400 nm 范围内的吸光度4 分钟(12 次扫描)。然后,使用移液器将 20 µL 亚硫酸盐氧化酶悬液依次加入每个标样中并混合。使用动力学应用程序,通过 45 分钟内 340 nm 处降低的吸光度来监测 NADH 的消耗。在反应结束时,使用表 3 中用于测量吸光度 (A1) 的相同参数(参数 2)测量标准溶液的吸光度 (A2)。使用导出到 MSExcel 的数据,按照公式 3 计算总亚硫酸盐 (SO2)。结果汇总于表 6 中。

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监测 NADH 随时间的消耗情况Cary 紫外工作站动力学应用程序用于监测添加亚硫酸盐氧化酶后 NADH 的消耗情况。仪器同时测量 7 个标样,监测 45 分钟内每个标样在 340 nm 处的吸光度(图 3)。与每个标样单独测量,总测量时间需要 5 多个小时相比,这种方法可节省大量的时间。Cary 3500 具有高数据采集速率(多达 250 个数据点/秒)和宽光度测量范围,不含活动部件。这些功能可确保在所有测量类型下均可采集准确的数据。

 

结论Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计能够在单次实验中同步监测 7 个标样中 NADH 的消耗情况。与单独测量每个标样相比,这种方法可节省 5 个多小时的测量时间。同步测量还意味着 7 个标样均在相同的条件下进行检测,从而消除了任何测量变量(例如环境温度的变化)。根据 USP43-NF38 方法测定了蔗糖中的总亚硫酸盐含量。同步测量多个样品能够尽可能减少环境、操作人员和仪器引入的误差,提高数据质量。可选的 Agilent OpenLab 软件用于支持数据采集过程的 Part 11/附录 11 合规性。Cary 3500 可通过软件控制的搅拌功能在整个测量期间混合样品池中的所有反应物。

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