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为热熔实验提供更快的升温速率-- 紫外可见分光光度计

发布时间:2022-06-25   点击次数:150次

前言:升高温度可诱导双链核酸分离为单链。在一定温度下,碱基对之间的氢键发生断 裂。热熔实验利用了 DNA 腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A=T) 与鸟嘌呤-胞嘧啶 (GΞC) 或 RNA 腺 嘌呤-尿嘧啶 (A=U) 和鸟嘌呤-胞嘧啶核苷酸之间氢键数的差异。由于 GΞC 核苷酸含 有三个氢键,解离所需热能大于双键对所需的热能。这表示含有更多 GΞC 对的 DNA 和 RNA 要在更高的温度下才能熔解。熔解温度 (Tm) 可指示样品中的碱基组成(GΞC 与 A=T/U=T 的比例)。 使用紫外-可见分光光度法测定熔点,利用的是单链核酸在 260 nm 处的吸光度高于 双链核酸的原理[1]。图 1 显示了使用小干扰 RNA (siRNA) 样品的示例,与 25 °C 相 比,85 °C 下 260 nm 处的吸光度明显更高。

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通常通过测定 260 nm 处的吸光度来进行热熔实验。然后在 受控 pH 和离子强度条件下逐渐升高样品温度。通常以每分钟 0.5 °C 的速率升温[2, 3, 4]。需要非常慢的升温速率才能确保准确 且可重现的数据。然而,缓慢的升温速率也意味着实验需要 很长时间。例如,以每分钟 0.5 °C 的速率将温度从 20 °C 升至 95 °C 需要 2.5 小时。实验室通常需要重复这些测量以确保可 重现的结果,因此完整的热熔实验可能十分耗时。 有很多方法可以缩短热熔测量所需时间。例如,一些仪器能够 将实验分成几个阶段,每个阶段使用不同的升温速率。可以在 开始和结束阶段使用快速升温速率,在样品变性的温度范围内 使用较慢的升温速率。 分光光度仪器的最新进展大大缩短了热熔测量所需的时间,温 度精度比以往更高。Agilent Cary 3500 多区控温紫外-可见分 光光度计使用集成的比色皿内温度探头,可在实验过程中准确 控制溶液温度。多池支架内置于仪器中,使用无水、风冷的帕 尔帖控温模块将样品温度控制在 0–110 °C 之间。 本研究使用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计评估升 温速率对 siRNA 样品熔解温度 (Tm) 计算值的影响。


实验部分 样品 siRNA 样品由安捷伦核酸解决方案事业部提供。使用含 100 mmmol/L NaCl、0.1 nmmol/L EDTA 和 10 mmmol/L 磷 酸钠的缓冲溶液配制 ≈ 0.3 mg/mL 的 siRNA 溶液,调节至 pH 7.0。 使用标准 3.5 mL 体积、10 mm 光程的石英比色皿。使用纯磷 酸盐缓冲液作为参比溶液。 仪器和方法 所有测量均采用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计。 方法参数见表 1。 研究期间改变的参数是升温速率。共使用了八个升温速 率:0.5、1、5、10、15、20、25 和 30 °C/min。 所有测量均使用至少三个平行样品在相同条件下同步进行测 量。将每个样品比色皿与参比样配对放置在八位多池支架 中。将比色皿内温度探头插入每个样品比色皿中(图 2),该 探头可用于控制实验温度。

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如图 3 和表 2 所示,对于实验中使用的八个升温速率,siRNA 样品的测量 Tm 值误差均在 ±1 °C 之内。


结论 采用 Cary 3500 多区控温紫外-可见分光光度计以八个不同 的升温速率测量同一个 siRNA 样品的熔点。各个升温速率下 测得的熔点误差均在 ±1 °C 范围内,表示实验室可以使用比 0.5 °C/min 的常规方案更快的升温速率。使用更快的升温速率 可以在不影响结果的前提下大大缩短实验时间。本研究表明, 使用 Cary 3500 可以在约 5 分钟内测定之前需要 2.5 小时才能 完成的实验。至少同步进行三次重复测定同样能够大大节省分 析时间。 使用较快的升温速率可扩展到其他紫外-可见吸光度随温度变 化的测量,为进行控温实验的实验室提供了显著的分析效率优 势。能够同步测量所有八个比色皿位置,进一步提升了致力于 研究液体样品对温度变化响应的实验室的分析效率。

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