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液质联用仪对动物源食品中的36种兽药进行筛查

发布时间:2022-08-10   点击次数:332次

 前言:QuEChERS 方法最初用于水果和蔬菜中的农药萃取 [1]。QuEChERS 操作分为两个步骤,萃取/分配和分散 SPE(dSPE)。在第一步中,乙腈作为萃取溶剂;使用硫酸镁和盐促进分配/萃取。在第二步中,采用 d-SPE 去除萃取物中的基质干扰。d-SPE 的材料一般包括 N-丙基乙二胺(PSA)、封端C18(C18EC)和石墨化碳黑(GCB)。通过验证,QuEChERS 方法已被用于多种样品基质的处理。相比于水果和蔬菜,本文涉及到的动物源食品样品需要在 d-SPE过程中采用 PSA 和 C18EC 去除这类样品中增加的蛋白质和脂类干扰。本文分析的兽药不需要使用 QuEChERS 缓冲盐,即原 AOAC或 EN QuEChERS 方法系用于萃取 pH 不稳定农药的盐。本方法由于其高选择性和高灵敏度,在分析复杂食品基质中痕量级的目标农药时非常耐用和快速。与固相萃取(SPE)相比,QuEChERS 方法会带来更多的基质干扰,因为它是一种“刚好够用"的样品制备技术。因此,需要高选择性的仪器,如使用带 DMRM 检测模式的 LC/MS/MS 对兽药进行简便准确的分析。采用本文描述的 LC/MS/MS 方法,动物源食品中的 36 种兽药可以在 9 min 内实现有效的分离。本法联用快速 QuEChERS 萃取,减少了大量操作步骤和分析人员的时间,为常规工作中兽药的筛查提供了一个可靠的方法。


实验部分试剂与标准品所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或者分析纯。甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)购自 Honeywell 公司(马斯基根,密歇根州,美国)。甲酸(FA)和乙酸购自 Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。


溶液和标准溶液将 1 mL 甲酸加入 100 mL ACN 中,混匀,制备 1% 甲酸 ACN 溶液,每天新鲜配制。将 1 mL 乙酸加入 100 mL ACN 中,混匀,制备 1% 乙酸 ACN 溶液,每天新鲜配制。标准溶液制备的浓度为 10 µg/mL(磺胺类和大环内酯类)、5 µg/mL(氯吡多)和 1 µg/mL(喹诺酮类)。仪器与材料配备二极管阵列检测器的 Agilent 1260 HPLC (安捷伦科技有限公司,加利福尼亚州,美国)。带有 AJST 电喷雾离子源的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统(安捷伦科技有限公司,加利福尼亚州,美国)。Agilent Bond Elut QuEChERS 硫酸镁(部件号 5982-8082)Agilent Bond Elut 氯化钠(部件号 5982-5750)Agilent Bond Elut PSA(部件号 5982-8382 或 5982-5753)Agilent Bond Elut C18EC(部件号 5982-1382 或 5982-5752)Agilent Bond Elut SAX(部件号 12213042)Agilent Bond Elut NH2(部件号 12213021)药物残留分析用 Agilent Bond Elut d-SPE(部件号 5982-4956)Agilent Bond Elut QuEChERS 不带缓冲盐萃取试剂盒(部件号5982-5550)Agilent ZORBAX Solvent Saver HD Eclipse Plus C18,3.0 ×100 mm,1.8 µm 色谱柱(部件号 959757-302)

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样品制备样品匀浆空白的猪肉、牛奶、蜂蜜和鸡蛋样品购自当地一家杂货店。样品洗净并剁碎(视需要),然后于 -20 °C 保存。萃取取 2 克(±0.05 g)各样品(视需要匀浆),置于 50 mL 离心管中。向样品中加入 200 µL 兽药标准溶液,使浓度分别为 10 ng/g(磺胺类和大环内酯类)、5 ng/g (氯吡多)和 1 ng/g (喹诺酮类)。加入 4 mL 水,涡旋样品 1 min。每管中加入 10 mL1% 乙酸 ACN 溶液。盖上离心管并涡旋 1 min。 将萃取盐(4 gNa2SO4,1 g NaCl)加入各管中。样品管加盖并且剧烈振摇1 min。 在 4 °C 下以 5000 rpm 的速度离心 5 min,放置 30 min。分散 SPE取 6 mL 上层 ACN 相,转移至装有 50 mg PSA、150 mg C18EC和 900 mg 无水 Na2SO4的 15 mL 试管中。将试管盖紧,涡旋 1 min,然后以 5000 rpm 的速度离心 5 min。将 4 mL 上层 ACN 相转移至另一试管中,40 °C 下氮气吹干。用 1 mL ACN/H2O 溶液(2 : 8)复溶样品残渣,然后以 10000 rpm 的速度离心 10 min。将上层相溶液转移至自动进样瓶中。


结果与讨论色谱条件优化Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统在 600 bar 的最高压力下可快速获得质量的数据结果。结合使用 Eclipse Plus C18亚 2 µm 填料色谱柱,该分析系统可以改善分离度,缩短分析时间,提高检测灵敏度,这些改进对于兽药筛查都极为重要。Agilent6460 MS/MS 系统具有高检测灵敏度,先进的六极杆碰撞池可以消除背景噪音和交叉污染,并且创新的动态多反应监测(DMRM)方法在 LC 分离过程中即可根据每个分析物的保留时间窗建立离子对列表。基质标准溶液中 36 种兽药(磺胺类和大环内酯类 10 ng/g、氯吡多 5 ng/g 和喹诺酮类 1 ng/g)的 LC/MS/MS 分离状况见图 1。每种化合物的 MS 条件见表 1。

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萃取和分散 SPE 参数的改进在初始评价阶段,我们使用安捷伦 Bond Elut 无缓冲盐和用于药物残留的 Bond Elut QuEChERS d-SPE 试剂盒。在方法开发期间,我们发现有必要改进操作步骤。这些改进可以使回收率满足常规分析的要求,详情如下所述。这个方法已成功应用于如下样品基质的处理:肉类、蜂蜜、蛋类和奶类。萃取步骤的优化首先,药物残留的 d-SPE 过程(150 mg C18,900 mg MgSO4)在方法1、2、3 和 4(表 2)中使用,以评价萃取步骤改进的效果。萃取盐包QuEChERS 方法使用 MgSO4 去除样品中的水分。实验表明,MgSO4 的使用对许多化合物的回收率有负面影响,尤其是磺胺类和大环内酯类药物。用 Na2SO4 替代 MgSO4,并且离心后将样品静置 30 min,可以有效地吸收水分 [2]。结果表明,用 Na2SO4替代 MgSO4,可以提高磺胺类和大环内酯类药物的回收率(表 2中的方法 1 和方法 2)。


萃取溶剂在萃取步骤中,还对水/乙腈的比例进行了评价。结果表明,萃取步骤中,采用比例为 1 : 2 的水/乙腈时,其回收率较比例为 1 : 1时的好(表 2 中的方法 2 和方法 3)。肉类基质的许多样品制备技术中常用酸去切断化合物-蛋白质的结合,这会直接影响其回收率。通常用于这种目的的酸是甲酸和乙酸 [3]。经比较表明,采用含 1% 乙酸的乙腈溶液处理样品的回收率大于采用含 1% 甲酸的乙腈溶液的处理效果。(表 2 中的方法 3和方法 4)。在四个方法的评价中,林可霉素的回收率都很低。推测是由于林可霉素具有强极性(log P = 0.56),限制了乙腈对它的萃取。

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表 3 的结果表明,方法 1 和 5 实现了回收率,它们分别采用了添加或不添加 PSA 的 C18EC。我们的目的是可以找到一个适用于我们所有样品基质的 d-SPE 处理方法。因此,在 d-SPE 过程中使用 PSA 非常重要,因为它可以去除蜂蜜基质中普遍存在的有机酸和糖。 最终选择的 d-SPE 参数为 50 mg PSA、150 mgC18EC 和 900 mg Na2SO4。其它样品基质除了肉类基质,本方法也成功用于蛋类、奶类和蜂蜜基质样品的处理。这些基质样品的回收率良好,满足常规兽药定量分析要求(附录 I)。


结论采用改进的 QuEChERS 方法,结合使用 LC/MS/MS,可以成功实现省时的动物源基质样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多兽药的筛查。本文优化的最佳 QuEChERS 组成为:4 g Na2SO4、1 g NaCl 作为萃取盐,乙腈(1% 乙酸)作为萃取溶剂,d-SPE 过程中使用 50 mg PSA、150 mg C18EC 和 900 mg Na2SO4。改进的QuEChERS 方法回收率满足常规兽药筛查的要求。

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