高效液相色谱分析进行完整甘油三酯的高分离度反

摘要 ：用配置紫外/可见光（UV/VIS）二极管阵列检测器（DAD）的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统在无水反相梯度条件下，分析大豆油中的甘油三酯。使用 Agilent 1290 Infinity液相色谱系统在不同长度、1.8 µm 充填粒度、600bar（9000psi）或 1200bar（18,000 psi）压力下、内径为 3.0 mm 和 2.1 mm 的 C18 色谱柱上进行样品的色谱分离。本报告演示了异丙醇（IPA）或甲基叔丁基醚（MTBE）作为强溶剂和乙腈作为弱组分的混合流动相条件下，Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统能够采用高分离度长色谱柱。

前言对来自动物或植物的完整甘油三酯进行分析具有很强的实用价值，包括加深对甘油三酯化学组成的理解、评估燃料潜热、了解生物系统的脂代谢行为。高效液相色谱（HPLC）成功分析这些组分的基本条件包括：梯度洗脱及整体分离过程的低波长监测。甘油三酯发色团相对较少，这有利于使用蒸发光散射检测器（ELSD）或质谱仪，以便于实现分离的其他目的。在此应用的开发过程中，我们对来自大豆、玉米、米糠、红花、葡萄籽、橄榄及棕榈油的植物油进行了分析。由于大豆油在美国广泛使用，且对生物燃料生产的意义不断增长，本应用的主要工作是最大限度地使大豆油甘油三酯的分离度符合标准要求。这些基本条件也适用于各种包括源自动物脂肪的样品。完整甘油三酯通常水溶性非常低，因此常采用常规色谱法进行分离，该方法主要依靠极性功能团的差异分离样品，或非水分离模式的反相色谱法，它对于如链长或链不饱和度等碳性的微小差异有更好的选择性。据珀金斯公布的资料[1]，在大豆油中发现的主要脂肪酸（甘油三酯的甘油骨干组成部分）是肉豆蔻（14:0）、棕榈（16:0）、油酸（18:1 ）、亚油酸（18:2）和亚麻酸（18:3），也存在许多其他小脂肪酸。因为脂肪酸都是随机构造为甘油三脂，所以脂肪酸亚结构的广泛转换是可能存在的。由于脂肪酸之间的主要差别是碳链长度和双键数，所以甘油三酯的多样性主要呈现非极性有机结构的特征。因此，反相色谱适于此类应用。由于甘油三酯的水溶性极差，您可以选择一个与水含量相关的较高的有机起始点，或如本报告，选择一个无水的分离环境。甘油三酯的典型结构如图 1 所示[2]。在这个图中，从上到下，分别为棕榈酸（C16:0）、油酸（C18:1）、a-亚麻酸（C18:3），显示了其链长和不饱和度。化学式为C55H98O6。

实验样品制备初始溶液的浓度为 10 mg/mL，异丙醇或甲醇/甲基叔丁基醚体积比为 2:1，随后根据需要稀释到更低浓度。LC/DAD 系统的进样量为 0.2-2 µL。LC 方法详细说明液相色谱条件Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统二元泵 G4220A,Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统自动进样器 G4226A配切换阀的安捷伦柱温箱 G1316C配有 10mm 通径光纤流通池的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统二极管阵列紫外/可见检测器 G4212A色谱柱: （具体使用见各自的色谱图）Agilent ZORBAX SB-C18 RRHT，3 mm × 150 mm, 1.8 µm600 bar，部件号 829975-302Agilent ZORBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm1200 bar, 部件号 858700-902Agilent ZORBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm × 150 mm, 1.8 µm1200 bar, 部件号 859700-902某些情况下，色谱柱要串联以增加长度和分离度柱温: 20 °C 或 30 °C流动相： A=乙腈B=异丙醇(IPA)或甲基叔丁基醚(MTBE)（具体流动相见各自的色谱图）流速： 具体流速见各自的色谱图梯度： 基于与 IPA 相比，MTBE 的洗脱强度高，梯度条件为 20% 至60% 的异丙醇或 10% 至 40% 的 MTBE。对于异丙醇梯度，梯度斜率一直维持在每柱容增加 2.6% 的有机相，MTBE 为 2.0%，相应地改变梯度时间和流速。这是使用安捷伦方法转化器计算而确定的[3]。

UV 条件：监测 210 nm、220 nm 和 230nm，带宽 4nm，参考波长关闭

结果和讨论以乙腈 IPA 梯度对甘油三酯的典型梯度分离如图 2 所示。一些通用的解释适用于图 2 中所示的条件和色谱图。虽然理想的弱洗脱液是价格略低的甲醇，而甲醇或者是含有甲醇的改性乙醇的引入使甘油三酯的整体分离度显著降低。当从异丙醇到乙腈的梯度运行时，操作压力的大幅度增加明显受限，不可取。采用提高色谱柱的操作温度来降低溶剂粘度的方法已被证明是不可取的，因为色谱分离能力往往随着温度上升而衰减。