摘要本应用报告报道了：• 高分离度快速液相色谱（RRLC）分析三七方法的方法建立• 从常规HPLC到RRLC方法转换的结果• 用RRLC方法在保持复杂组分良好分离度的同时，缩短了分析时间，同时提高了样品通量、降低了成本• 用优化方法得到的色谱图显示，从三七不同部位得到的样品色谱峰轮廓不同，某些皂甙的浓度也不同
前言中药（TCMs）具有悠久的用药历史，其疗效在中国及韩国、日本等亚洲国家都得到认可。在西方国家，也越来越普遍地将中药作为食品添加剂或营养补剂。被使用过的中药已经有11,000多种。对中药的研究和质量控制很大程度上依靠仪器分离和分析的性能。本研究建立了一种分析三七的高分离度快速液相色谱(RRLC)方法。用安捷伦方法转移器轻松地将常规HPLC 分析方法转为 RRLC 方法。用不同提取方法从三七植物的不同部位制备不同样品 。用优化的方法分离这些样品，得到的色谱图显示了不同的色谱峰轮廓。本应用报告还报道了定量结果。质控部门使用本研究中建立的更快、更好的方法，将缩短分析时间，提高样品通量。使用这些方法还能节省溶剂消耗，改善整个分析过程。三七，中文名三七或田七，在中国是一种重要而昂贵的药材。它已经有400多年的栽培历史，85%以上的三七都产自中国云南省。三七的功效在于促进血液循环、去除血液瘀积包括凝血，治疗肿胀、缓解疼痛。最近的药理学研究显示，三七具有抗癌和保肝作用，如，对心血管和脑血管系统有保护作用1。三七的皂甙种类与著名的人参和西洋参 (花旗参)相似，因为它们都属于同一种属。三七主要用于中国南方的不同验方。著名的中成药云南白药和片仔癀中也含有三七。中药的复杂基质常常给质量控制和研究带来挑战。2005版中国药典收载了药材三七及其复方制剂，如三七伤药片，其中含有三七皂甙R1，是这些制剂中必须分析的成分。三七皂甙的分析时间一般是 60 多分钟。随着对中药的研究越来越深入，科学家们认为只控制1到2个成分还不足以确定中药的质量，必须开发分离更多组分的质量控制方法。像中药这种复杂样品的分离比合成药物的分离需要更长的分析时间。当需要考虑样品通量问题时，理想的解决方案就是在较短的分析时间内达到相似或更高的性能。使用RRLC有可能开发出分析时间更短、性能更好，又节省溶剂的方法。对于生产质量控制来说，使用RRLC意味着产品批次的检定出厂可以比使用常规HPLC方法更快。
实验仪器用于开发 RRLC 方法的 Agilent1200系列高分离度快速液相色谱系统包含以下组件：Agilent 1200系列 RRLC系统包括：• Agilent 1200 系列SL型二元泵，带真空脱气机• Agilent 1200系列SL型高性能自动进样器• Agilent 1200 系列SL型柱温箱• Agilent 1200 系列SL型二极管阵列检测器，配置微量流通池(2 µL体积，3 mm光程)• Agilent 化学工作站 B.02.01SR1，用于数据采集和分析• Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色谱柱，4.6 x 50 mm, 1.8 µm粒径常规HPLC为标准配置Agilent 1100系列液相色谱，包含以下组件：• Agilent 1100 系列二元泵，带脱气机• Agilent 1100 系列自动进样器• Agilent 1100 系列柱温箱• Agilent 1100 系列二极管阵列检测器• Agilent ZORBAX SB C18色谱柱，4.6 x 50 mm, 5 µm粒径
三七皂甙 R1、人参皂甙Rg1和人参皂甙Rb1标准品购自中国国家药品与生物制品检定所(NICPBP)，人参皂甙Re和人参皂甙Rc标准品购自美国SigmaAldrich公司。• 三七茎叶提取物(NCLE)由用户实验室提供。茎和叶用60%乙醇提取，溶剂蒸干后残渣用正丁醇溶解，再将溶剂挥发掉，残留黄色粉末用甲醇溶解，待进样。3• 三七根提取物（NRE）由用户实验室提供。粗品用水提取，用大孔滤膜过滤，滤液挥发至干。残留白色粉末状物质用甲醇溶解，待进样。• 三七购自当地一家药材商店（品牌为同仁堂）。粗品用水/甲醇(30/70, v/v)超声萃取30分钟，用0.22微米滤膜过滤，用澄清的滤液进样。• 水、乙腈和甲醇均购自美国Fisher公司。
方法转换需要将使用填充5 µm填料色谱柱的常规HPLC方法转换成使用填充1.8 µm填料色谱柱的RRLC方法。使用安捷伦方法转换计算器( 可用光盘，Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱系统，发行号5989-5130EN)，可使这一过程简便、快速(图1)。方法转换计算器上列出了各种不同参数，可以根据具体需求对转换后的方法进一步改进。如需了解如何将一个常规HPLC方法手动转换成RRLC方法，请参阅安捷伦相关应用报告2,3,4。
结果与讨论色谱图药理学研究结果显示，三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的药效。使用特殊的提取方法以达到获得更多有效成分的目的。用常规HPLC方法和RRLC方法分析三七样品得到不同的峰轮廓。图2显示了用常规HPLC方法分析三七茎和叶提取物(NCLE)得到的色谱图。这种分析通常需要60多分钟5。如实验部分所述，用于分析三七样品的RRLC方法是在常规HPLC方法的基础上开发的。用常规HPLC方法和 RRLC 方法分析了相同的NCLE样品。色谱图见图2和图3。图 3 中的色谱峰比图 2 中的更窄。这意味着分离复杂样品的峰容量增加了。RRLC分析的分离度或分离性能优于常规HPLC。同时，分析时间从60分钟明显缩短到20分钟。另一个要考虑的因素是常规HPLC和 RRLC 柱的选择性应保持一致。如果新的RRLC柱与常规HPLC柱相比具有不同的选择性，方法转换将失去意义。在本研究中，峰轮廓和洗脱顺序都相同，所以不需要再对新色谱图中的峰进行鉴定。而且，二极管阵列检测器得到的UV 光谱图将有助于进一步对色谱峰进行确证。
