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基于二氧化钛富集策略的人类 磷酸化蛋白质组大规模鉴定

发布时间:2019/4/14   点击次数:98
 
提 供 商: 上海斯迈欧分析仪器有限公司 资料大小:
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蛋白质磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰,其在细胞周 期、细胞增殖分化、代谢和凋亡等各个生物学过程中都起 到了重要的调控作用。在真核生物中,约有 1/3 的蛋白质 处于其磷酸化状态,不同的蛋白质其磷酸化水平差异很大, 从低于 1% 到高达 90% 不等[1]。

 

 

磷酸化蛋白质组学面临着诸多技术挑战,如:磷酸化蛋白 质丰度较低且动态范围大,磷酸化肽段的离子化效率相 对偏低,磷酸修饰基团的具体位置难以确定,等等。在 目前的磷酸化蛋白质组学研究中,通常都需要在质谱分 析前对样品中的磷酸化肽段进行富集,以消除非修饰肽 段对于磷酸化肽段的鉴定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法 主要包括固定化金属亲和色谱(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)[3],二氧化钛(Titanium dioxide, TiO2)[4] 以及基于抗体的富集方法[5]。其中二氧化钛方法有 着富集效率高,简单易操作的优势,从而成为了目前广 泛使用的富集方法。为了进一步增加磷酸化位点的鉴定深 度,通常需要对磷酸化肽段进行预分级,包括采用离子 交换色谱[6],高 pH 反相色谱[7],亲水相互作用色谱[8],以 及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在这部分工作中,我们采用 TiO2 富集结合多种肽段预分级的策略,通过 Orbitrap 采 集 HCD 产生的二级碎片离子,并终使用 MaxQuant 的 PTM score 系统进行磷酸化位点的确认,从而得到了高达 40,000 个位点的 Hela 细胞磷酸化蛋白质组深度覆盖。 

 

Hela 细胞用 SDT 裂解液裂解,并用 FASP 方法酶解[10]。 TiO2 富集磷酸化肽段的方法参考文献[9]。肽段高 pH 反相 色谱预分级的方法参考文献[7]。磷酸化肽段 SCX 分级的 方法参考文献[11]。

色谱条件:液相色谱仪:Easy nLC 1200(ThermoFisher Scientific) 

 
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