蛋白质磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，其在细胞周 期、细胞增殖分化、代谢和凋亡等各个生物学过程中都起 到了重要的调控作用。在真核生物中，约有 1/3 的蛋白质 处于其磷酸化状态，不同的蛋白质其磷酸化水平差异很大， 从低于 1% 到高达 90% 不等[1]。

磷酸化蛋白质组学面临着诸多技术挑战，如：磷酸化蛋白 质丰度较低且动态范围大，磷酸化肽段的离子化效率相 对偏低，磷酸修饰基团的具体位置难以确定，等等。在 目前的磷酸化蛋白质组学研究中，通常都需要在质谱分 析前对样品中的磷酸化肽段进行富集，以消除非修饰肽 段对于磷酸化肽段的鉴定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法 主要包括固定化金属亲和色谱（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）[3]，二氧化钛（Titanium dioxide, TiO2）[4] 以及基于抗体的富集方法[5]。其中二氧化钛方法有 着富集效率高，简单易操作的优势，从而成为了目前广 泛使用的富集方法。为了进一步增加磷酸化位点的鉴定深 度，通常需要对磷酸化肽段进行预分级，包括采用离子 交换色谱[6]，高 pH 反相色谱[7]，亲水相互作用色谱[8]，以 及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在这部分工作中，我们采用 TiO2 富集结合多种肽段预分级的策略，通过 Orbitrap 采 集 HCD 产生的二级碎片离子，并终使用 MaxQuant 的 PTM score 系统进行磷酸化位点的确认，从而得到了高达 40,000 个位点的 Hela 细胞磷酸化蛋白质组深度覆盖。 

Hela 细胞用 SDT 裂解液裂解，并用 FASP 方法酶解[10]。 TiO2 富集磷酸化肽段的方法参考文献[9]。肽段高 pH 反相 色谱预分级的方法参考文献[7]。磷酸化肽段 SCX 分级的 方法参考文献[11]。

色谱条件：液相色谱仪：Easy nLC 1200（ThermoFisher Scientific）